Valutazione della migrazione dei linfociti in un sistema di trasmigrazione Ex Vivo

Questo metodo di trasmigrazione originale è stato presentato da Stephen Boyden nel 1962 nel Journal of Experimental Medicine¹. Gran parte di ciò che sappiamo sulla chemiotassia e sulla chemiocinetia non sarebbe possibile senza lo sviluppo della camera di Boyden. Prima della scoperta della prima chemiochina nel 1977, i sistemi di trasmigrazione ex vivo sono stati utilizzati per conoscere i fattori del siero che potrebbero arrestare il movimento cellulare nei macrofagi amplificando la motilità cellulare nei neutrofili^1,2. Una massiccia ricchezza di conoscenze è stata sviluppata per quanto riguarda la migrazione delle cellule immunitarie, e ad oggi, 47 chemiochine sono state scoperte con 19 recettori corrispondenti^3,4. Inoltre, moltitudini di inibitori/miglioratori di queste vie chemiochine hanno subito lo sviluppo per scopi terapeutici^5,6,7,8. Molti di questi composti sono stati testati in camere di trasmigrazione simili per comprendere le interazioni dirette tra i composti e la reattività delle cellule immunitarie a una data chemiochina⁹.

La trasmigrazione, o diapedesi, nel tessuto infiammato è un processo essenziale per una risposta infiammatoria sana alla chiara infezione^10,11. Una camera Boyden, un sistema di trasmigrazione o un apparato transwell sono generalmente composti da due camere separate da una membrana porosa^1,12. La camera inferiore contiene più spesso supporti contenenti la chemiochina di interesse, mentre i leucociti sono collocati nella camera superiore. La dimensione del poro nella membrana può essere selezionata in base alle dimensioni della cella di interesse. Per questo progetto, abbiamo selezionato una membrana porosa di 3 m, poiché le cellule linfoidi hanno una dimensione di 7-20 m, a seconda dello stadio di sviluppo cellulare. Questa dimensione dei pori assicura che queste cellule non cadono passivamente attraverso i pori, ma che stanno migrando attivamente in risposta al gradiente della chemiochina.

Il principale vantaggio di questo protocollo è la sua efficacia in termini di costi. La trasmigrazione in vivo è difficile perché richiede un’ampia formazione nella manipolazione e nella chirurgia degli animali, e spesso coinvolge microscopia ad alta potenza che non è sempre disponibile per un ricercatore. Lo screening economico dei composti pensati per migliorare o inibire la trasmigrazione può essere realizzato prima dell’imaging in vivo. Poiché il sistema di trasmigrazione è strettamente controllato, le cellule possono essere trattate inizialmente e poi aggiunte all’apparato transwell, o, viceversa, la chemiochina può essere trattata prima con un inibitore della chemiochina e poi le cellule aggiunte all’apparato transwell. Infine, le cellule endoteliali e/o le proteine della membrana sotterranea possono essere aggiunte sul fondo dell’inserto transwell 1-2 giorni prima dell’esperimento di trasmigrazione per comprendere il coinvolgimento di queste cellule barrierative nella chemiocinetica. Ancora una volta, queste manipolazioni del sistema forniscono un potente mezzo per determinare importanti informazioni sull’efficacia di un dato composto prima di studi in vivo più complicati.

L’utilizzo di un sistema camera di trasmigrazione è un modo efficace per valutare la mobilità dei linfociti in varie condizioni in vivo e in vitro^12,13,14. Qui, descriviamo un metodo ottimizzato per valutare la reattività dei linfociti ex vivo alle chemiochine in una camera di trasmigrazione. In questo esperimento di esempio, CD4^– cellule T e cellule linfoidi innate di gruppo 2 (ILC2) sono state isolate dai topi maschi e femmine, BALB/c in seguito all’esposizione all’OVA-allergene. È stata generata un’ipotesi che CCR4^– CD45^– Lineage- (LIN-) ILC2 da topi con problemi di allergene migrerebbe in modo più efficiente verso CCL17 e CCL22 rispetto alle cellule helper CCR4 – CD4^– T. CCL17 e CCL22 sono chemiochine comunemente prodotte da cellule dendritiche e macrofagi del fenotipo M2 (allergico), tra le altre cellule, nell’allergia^15,16. CCL17 e CCL22 possono essere considerati come biomarcatori di infiammazione allergica in quanto sono prontamente rilevati nei polmoni durante le esacerbazioni delle vie^{aeree 16,17,18}. È importante sottolineare che l’espressione di CCR4 è elevata rispetto ai controlli non trattati, come rivelato nei dati bioinformatici generati da ILC2 isolati da animali trattati con acari della polvere domestica, e allo stesso modo ILC2 da animali ingenui trattati ex vivo con IL-33 ( citochina innata che promuove gli allergeni) aumenta la regolazione CCR4^19,20. Inoltre, secondo i dati relativi all’ILC2 nel database del progetto immunologico del genoma (www.immgen.org), l’mRNA CCR4 è altamente espresso in queste cellule immunitarie innate. Ad oggi, poco è noto per quanto riguarda il traffico di ILC2 in tessuti, ma è probabile che le cellule ILC2 e CD4^– T utilizzano chemiochine e recettori simili per chemiotassi e chemiocinetiche in quanto esprimono fattori e recettori di trascrizione simili. Così, abbiamo confrontato CCL17 e CCL22 reattività, di ILC2 e CD4^– linfociti T, da entrambi gli animali maschi e femmine, OVA-sfidato.