Dans ce protocole, les lymphocytes sont placés dans la chambre supérieure d’un système de transmigration, séparés de la chambre inférieure par une membrane poreuse. La chimiokine est ajoutée à la chambre inférieure, qui induit une migration active le long d’un gradient de chimiokine. Après 48 h, les lymphocytes sont comptés dans les deux chambres pour quantifier la transmigration.
Ici, nous présentons une méthode efficace qui peut être exécutée avec les qualifications et les matériaux de laboratoire de base pour évaluer le mouvement chimio-entique de lymphocyte dans un système de transmigration ex vivo. Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2) et les cellules d’aide CD4t ont été isolées des rates et des poumons des souris BALB/c de BALB/c d’ovalbumine d’oeufde de poulet (OVA). Nous avons confirmé l’expression de CCR4 sur les deux cD4– lymphocytes T et ILC2, comparativement. LE CCL17 et le CCL22 sont les ligands connus pour le CCR4; par conséquent, en utilisant cette méthode de transmigration ex vivo, nous avons examiné le CCL17– et le mouvement induit par le CCL22 deslymphocytes CCR4. Pour établir des gradients de chimiokine, CCL17 et CCL22 ont été placés dans la chambre inférieure du système de transmigration. Des lymphocytes isolés ont alors été ajoutés aux chambres supérieures et sur une période de 48 h les lymphocytes ont activement migré par des pores de 3 m vers la chimiokine dans la chambre inférieure. Il s’agit d’un système efficace pour déterminer la chimioïque des lymphocytes, mais, naturellement, n’imite pas les complexités trouvées dans les microenvironnements in vivo d’organe. C’est une limitation de la méthode qui peut être surmontée par l’ajout de l’imagerie in situ de l’organe et des lymphocytes à l’étude. En revanche, l’avantage de cette méthode est que peut être effectuée par un technicien d’entrée de gamme à un taux beaucoup plus rentable que l’imagerie en direct. Comme les composés thérapeutiques deviennent disponibles pour améliorer la migration, comme dans le cas de la tumeur infiltrant les cellules immunitaires cytotoxiques, ou pour inhiber la migration, peut-être dans le cas des maladies auto-immunes où l’immunopathologie est préoccupante, cette méthode peut être utilisée comme un outil de dépistage. En général, la méthode est efficace si la chimiokine d’intérêt génère constamment des chimioïques à un niveau statistiquement plus élevé que le contrôle des médias. Dans de tels cas, le degré d’inhibition/amélioration par un composé donné peut également être déterminé.
Cette méthode originale de transmigration a été présentée par Stephen Boyden en 1962 dans le Journal of Experimental Medicine1. Une grande partie de ce que nous savons sur la chimiotaxie et la chimiothérapeutique ne serait pas possible sans le développement de la chambre Boyden. Avant la découverte de la première chimiokine en 1977, les systèmes de transmigration ex vivo ont été utilisés pour en apprendre davantage sur les facteurs sériques qui pourraient arrêter le mouvement cellulaire dans les macrophages tout en amplifiant la motilité cellulaire chez les neutrophiles1,2. Une énorme richesse de connaissances a été développée en ce qui concerne la migration des cellules immunitaires, et à ce jour, 47 chemokines ont été découverts avec 19 récepteurs correspondants3,4. En outre, des multitudes d’inhibiteurs/améliorateurs de ces voies de chimiokine ont subi le développement à des fins thérapeutiques5,6,7,8. Beaucoup de ces composés ont été testés dans des chambres de transmigration similaires pour comprendre les interactions directes entre les composés et la réactivité des cellules immunitaires à une chimiokine donnée9.
La transmigration, ou diapède, dans les tissus enflammés est un processus essentiel à une réponse inflammatoire saine à l’infection claire10,11. Une chambre Boyden, un système de transmigration ou un appareil de transwell sont généralement composés de deux chambres séparées par une membrane poreuse1,12. La chambre inférieure tient le plus souvent des supports contenant la chimiokine d’intérêt, tandis que les leucocytes sont placés dans la chambre supérieure. La taille des pores de la membrane peut être sélectionnée en fonction de la taille de la cellule d’intérêt. Pour ce projet, nous avons sélectionné une membrane poreuse de 3 m, car les cellules lymphoïdes ont une taille de 7 à 20 m, selon le stade du développement cellulaire. Cette taille de pores assure que ces cellules ne tombent pas passivement à travers les pores, mais qu’elles migrent activement en réponse au gradient de chimiokine.
Le principal avantage de ce protocole est sa rentabilité. La transmigration in vivo est difficile parce qu’elle nécessite une formation approfondie sur la manipulation et la chirurgie des animaux, et implique souvent une microscopie de haute puissance qui n’est pas toujours disponible pour un chercheur. Le criblage rentable des composés censés améliorer ou inhiber la transmigration peut être accompli avant l’imagerie in vivo. Puisque le système de transmigration est étroitement commandé, les cellules peuvent être traitées d’abord puis ajoutées à l’appareil de transwell, ou, vice versa, la chimiokine peut être traitée d’abord avec un inhibiteur de chimiokine puis des cellules ajoutées à l’appareil de transwell. Enfin, les cellules endothéliales et/ou les protéines membranaires du sous-sol peuvent être ajoutées au fond de l’insertion de transwell 1-2 jours avant l’expérience de transmigration pour comprendre l’implication de ces cellules de barrière dans la chimioïétique. Encore une fois, ces manipulations du système fournissent un moyen puissant de déterminer des informations importantes sur l’efficacité d’un composé donné avant des études in vivo plus compliquées.
L’utilisation d’un système de chambre de transmigration est un moyen efficace d’évaluer la mobilité des lymphocytes dans diverses conditions in vivo et in vitro12,13,14. Ici, nous décrivons une méthode optimisée pour évaluer la réactivité ex vivo de lymphocyte aux chemokines dans une chambre de transmigration. Dans cet exemple d’expérience, les lymphocytesT CD4 et le groupe 2 lymphoïdes innés (ILC2) ont été isolés chez des souris mâles et femelles, BALB/c après exposition ova-allergène. Une hypothèse a été générée que CCR4– CD45– Lineage- (LIN-) ILC2 à partir de souris à défi allergène migrerait plus efficacement vers CCL17 et CCL22 que CCR4– CD4– T cellules d’aide. CCL17 et CCL22 sont des chemokines couramment produites par les cellules dendritiques et les macrophages du phénotype M2 (allergique), entre autres cellules, dans l’allergie15,16. CCL17 et CCL22 peuvent être considérés comme des biomarqueurs de l’inflammation allergique car ils sont facilement détectés dans les poumons lors d’exacerbations des voies respiratoires16,17,18. Fait important, l’expression CCR4 est élevée par rapport aux témoins non traités, comme le révèlent les données bioinformatiques générées par ilC2 isolés à partir d’animaux traités par les acariens de la poussière domestique, et de même ILC2 d’animaux naïfs traités ex vivo avec IL-33 ( cytokine innée favorisant l’allergène) upregulates CCR419,20. En outre, selon les données pour ILC2 dans la base de données immunologique de projet de génome (www.immgen.org), l’ARNm cCR4 est fortement exprimé dans ces cellules immunitaires innées. À ce jour, on sait peu de choses concernant le trafic d’ILC2 dans les tissus, mais il est probable que les cellules ILC2 etCD4-T utilisent des chimiocines et des récepteurs similaires pour la chimiotaxie et la chimiogénie car elles expriment des facteurs de transcription et des récepteurs similaires. Ainsi, nous avons comparé la réactivité du CCL17 à la réactivité du CCL22, des lymphocytes ILC2 et CD4T, provenant à la fois d’animaux mâles et femelles, d’animaux à défi OVA.
Ici, nous présentons une méthode bien établie pour évaluer la migration chimiokine-induite des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, dont la première est de vérifier l’expression du récepteur correct de chimiokine sur les cellules immunitaires dans l’expérience. Dans nos mains, nous avons choisi CCR4 en raison du corps de la littérature qui souligne l’importance de CCR4 sur les cellules T aide Th2 dans l’inflammation allergique. L’inflammati…
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été financés par l’American Lung Association (K.J.W.), le fonds Memorial Eugene Kenney attribué à T.A.W. et K.J.W., un généreux soutien de démarrage de l’Université de l’Utah pour K.J.W., et un prix du ministère des Anciens Combattants à T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. est le récipiendaire d’un prix de chercheur en carrière scientifique (IK6 BX003781) du ministère des Anciens Combattants. Les auteurs tiennent à souligner l’aide éditoriale de Mme Lisa Chudomelka. Les auteurs remercient le noyau de cytométrie des flux de l’UNMC pour leur soutien dans la collecte des données de cytométrie de flux générées pour ce manuscrit.
0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |