هنا نقدم بروتوكول التفكك الميكانيكية لعزل الضامة بسرعة من العقدة الجذر الظهري للنماذج الظاهرية والتحليل الوظيفي.
هناك اهتمامات متزايدة لدراسة التفاعلات الجزيئية والخلوية بين الخلايا المناعية والخلايا العصبية الحسية في العقد ية الجذر الظهري بعد إصابة العصب المحيطي. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة، تستجيب لإصابة الأنسجة من خلال داء الفيغوسية، وعرض مستضد، وإطلاق سراح السيتوكين. وقد تورطت الأدلة الناشئة مساهمة الضامة جذور الظهر في تطوير الألم العصبي وإصلاح axonal في سياق إصابة الأعصاب. الفينول بسرعة (أو “العزلالسريع من”) استجابة الضامة الجذور الظهرية في سياق إصابة الأعصاب هو المطلوب لتحديد عوامل المناعة العصبية غير معروف. هنا نبين كيف أن مختبرنا يعزل الضامة بسرعة وفعالية من العقد الجذرية الظهرية باستخدام بروتوكول فك نأفة ميكانيكية خالية من الإنزيمات. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد في جميع أنحاء للحد من الإجهاد الخلوي. هذا البروتوكول هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة بالمقارنة مع البروتوكول الأنزيمي القياسية، وقد استخدمت بشكل روتيني لتحليلنا فرز الخلايا تنشيط الفلورة.
هناك الآن أدلة كبيرة على أن الخلايا المناعية تسهم في الألم العصبي بعد إصابة العصب المحيطي1،2. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة الناضجة، تستجيب لإصابة الأنسجة والعدوى الجهازية من خلال داء البلغم، وعرض المستضد، وإطلاق السيتوكين. بالتوازي مع تنشيط microglia الناجم عن إصابة الأعصاب في القرن الظهري الشوكي ، توسع الضامة في العقد ية الجذر الظهرية (DRG) بشكل كبير بعد إصابة الأعصاب3،4. وتجدر الإشارة إلى أن هناك مصالح متزايدة لتحديد ما إذا كانت الضامة تسهم في نمو الألم العصبي بعد إصابة الأعصاب المحيطية من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية الحسية في DRG5،6،7، 8 , 9 , 10 سنوات , 11.وعلاوة على ذلك، والدراسات الحديثة تورط أيضا مساهمة الضامة DRG في إصلاح axonal بعد إصابة الأعصاب12،13. وتشير دراسة أخرى كذلك إلى أن التجمعات السكانية الفرعية في الضامة (أي CD11b+Ly6Chi وCD11b+Ly6Cمنخفضة/- الخلايا) قد تلعب دوراً مختلفاً في فرط الحساسية الميكانيكية14. ولذلك، فإن الفينول بسرعة استجابة الضامة DRG في سياق إصابة الأعصاب قد تساعدنا على تحديد عوامل المناعة العصبية التي تسهم في الألم العصبي.
تقليديا ، فإن بروتوكول عزل الضامة في DRG ينطوي على خطوات متعددة بما في ذلك الهضم الأنزيمي15،16. وغالبا ما تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا ويمكن أن تكون مكلفة بالنسبة للتجارب الواسعة النطاق. على الرغم من أن الهضم الخفيف مع الكولاجين النوع الثاني (4 ملغ / مل) وديسباس النوع الثاني (4.7 ملغ / مل) لمدة 20 دقيقة أوصى سابقا15، فمن المتصور أن الخلايا بعد التعرض لهذا الإنزيم عرضة لتلف الخلايا أو موت الخلايا ، والتي قد تؤدي إلى انخفاض العائد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفرق في نوعية الإنزيمات من دفعة إلى دفعة قد يؤثر بشكل أكبر على كفاءة هذه العملية. والأهم من ذلك، الضامة المعرضة لهضم الإنزيم قد تكون محفزة بشكل غير مرغوب فيه، وبالتالي يمكن أن تكون مختلفة جدا عن الوضع في الجسم الحي. وقد تؤدي التغييرات إلى تعقيد نتائج الدراسة الوظيفية.
هنا نقوم بوصف بروتوكول خال من الإنزيم لعزل الضامة DRG بسرعة في 4 درجة مئوية باستخدام التفكك الميكانيكي. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد للحد من الإجهاد الخلوي. ونتيجة لذلك، يوفر نهجنا ميزة للحفاظ على اتساق العزلة، ويفترض أن الخلايا المعزولة هي أكثر صحة وأقل تحفيزا. كما نقدم الأدلة للتحقق من جودة الخلايا المعزولة مع تحليل فرز الخلايا المنشط ة الفلورية (FACS).
هنا نقدم طريقة جديدة لإثراء بفعالية الضامة المعزولة من الماوس DRG. النهج التقليدي لعزل الخلايا المناعية DRG يتطلب الهضم الأنزيمي15،18، والتي يتم استبدالها الآن مع التجانس الميكانيكية في بروتوكولنا للحد من تلف الخلايا غير المرغوب فيها وزيادة الغلة. ولذلك، فإن ?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم الدراسة من قبل: مؤسسة التثقيف والبحوث التخدير (XY)؛ قسم التخدير والرعاية المحيطة بالجراحة (XY) في جامعة كاليفورنيا في لوس أنسياف. و1R01NS100801-01 (GZ). وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مختبر HDFCCC لتحليل الخلايا مرفق الموارد المشتركة من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (P30CA082103).
AP20187 | Clontech | 635058 | |
a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
Avertin | Sigma | T48402 | |
Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |