Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Jason E Chung; Hannah  R Joo; Clay  N Smyth; Jiang Lan Fan; Charlotte Geaghan-Breiner; Hexin Liang; Daniel  Fan Liu; Demetris Roumis; Supin Chen; Kye  Y Lee; Jeanine  A Pebbles; Angela  C Tooker; Vanessa  M Tolosa; Loren  M Frank

doi:10.3791/59957

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Nörobilim

Implantation chronique de multiples réseaux d'électrodes polymères flexibles

Published: October 04, 2019

doi:

10.3791/59957

Jason E Chung*^1,2, Hannah R Joo*^1,2, Clay N Smyth², Jiang Lan Fan³, Charlotte Geaghan-Breiner², Hexin Liang², Daniel Fan Liu³, Demetris Roumis², Supin Chen^4,5, Kye Y Lee⁴, Jeanine A Pebbles⁴, Angela C Tooker⁴, Vanessa M Tolosa^4,5, Loren M Frank^2,6

¹Medical Scientist Training Program and Neuroscience Graduate Program,University of California San Francisco, ²Kavli Institute for Fundamental Neuroscience, Center for Integrative Neuroscience, and Department of Physiology,University of California San Francisco, ³Bioengineering Graduate Program,University of California San Francisco, ⁴Center for Micro- and Nanotechnology,Lawrence Livermore National Laboratory, ⁵Neuralink Corp., ⁶Howard Hughes Medical Institute

Özet

Décrit ci-dessous est une méthode pour l’implantation de plusieurs réseaux d’électrodes de polymère à travers les régions anatomiquement éloignées du cerveau pour l’enregistrement électrophysiologique chronique chez les rats en mouvement libre. La préparation et l’implantation chirurgicale sont décrites en détail, en mettant l’accent sur les principes de conception pour guider l’adaptation de ces méthodes pour une utilisation dans d’autres espèces.

Abstract

Des enregistrements simultanés de grandes populations de neurones individuels à travers des régions cérébrales distribuées sur des mois à des années permettront de nouvelles avenues de développement scientifique et clinique. L’utilisation de réseaux d’électrodes polymères flexibles peut soutenir l’enregistrement durable, mais les mêmes propriétés mécaniques qui permettent la longévité de l’enregistrement font des insertions multiples et l’intégration dans un implant chronique un défi. Voici une méthodologie par laquelle plusieurs réseaux d’électrodes de polymère peuvent être ciblés sur un ensemble relativement spatialement sans contrainte de zones du cerveau.

La méthode utilise des dispositifs en polymère à couches minces, sélectionnés pour leur biocompatibilité et leur capacité à atteindre des interfaces d’enregistrement électrophysiologique stables et à long terme. L’implant résultant permet un ciblage précis et flexible des régions anatomiquement éloignées, la stabilité physique pendant des mois, et la robustesse au bruit électrique. La méthodologie prend en charge jusqu’à seize dispositifs insérés en série sur huit cibles anatomiques différentes. Comme nous l’avons déjà démontré, la méthodologie est capable d’enregistrer à partir de 1024 canaux. De ce nombre, les 512 canaux de cette démonstration utilisés pour l’enregistrement d’un seul neurone ont donné 375 unités individuelles réparties sur six sites d’enregistrement. Fait important, cette méthode peut également enregistrer des unités individuelles pendant au moins 160 jours.

Cette stratégie d’implantation, y compris le soutien temporaire de chaque appareil avec une navette d’insertion de silicium rétractable, consiste à attacher des dispositifs à leur profondeur cible à une pièce de base en plastique adhéré au crâne qui est conçue sur mesure pour chaque ensemble d’enregistrement et la stabilisation/protection des appareils dans un boîtier en plastique rempli de silicone et conçu sur mesure. La préparation d’appareils d’implantation et les principes de conception qui devraient guider l’adaptation à différentes combinaisons de zones du cerveau ou de conceptions de tableaux sont également abordées.

Introduction

Un implant neuronal idéal enregistrerait à partir d’un très grand nombre de neurones individuels dans les zones du cerveau distribuées sur des semaines à des mois. Les réseaux flexibles d’électrodes de polymère fournissent des enregistrements électrophysiologiques avec la longévité pour enregistrer pendant des mois et la stabilité pour suivre les neurones individuels¹^,²^,³. Cependant, les mêmes propriétés mécaniques qui réduisent les dommages de tonte⁴ et confèrent la biocompatibilité et la capacité d’enregistrement²^,³^,⁵^,⁶^,⁷^, ⁸ posent un défi à leur insertion dans le cerveau par rapport à leurs homologues rigides. Les travaux antérieurs ont permis d’atteindre un maximum de quatre tableaux de 32 canaux, mais le rendement total des neurones uniques putatifs triés n’est pas déclaré²^,³^,⁹. Inversement, des réseaux d’électrodes à base de silicium ont été utilisés dans des implants multirégionaux à haute densité, mais ces technologies n’ont pas la capacité d’enregistrer les pics des neurones pendant des mois (longévité) ou de suivre les mêmes neurones (stabilité) sur cette échelle de temps, ou la densité à enregistrer à partir de centaines de neurones individuels à travers plusieurs régions du cerveau. La méthode présentée ici surmonte le faible nombre d’insertions dans les méthodes actuelles basées sur le réseau d’électrodes de polymère, fournissant ainsi des moyens pour l’enregistrement électrophysiologique d’un grand nombre de neurones individuels dans de multiples régions anatomiquement éloignées pour mois, avec la stabilité d’enregistrer à partir des mêmes neurones individuels sur de nombreux jours.

Il y a un certain débat concernant l’importance d’utiliser un substrat de polymère au lieu de microwire- ou des stratégies basées sur le silicium. Comme l’ont démontré Dhawale et coll.¹⁰, les microfils sont en effet capables d’enregistrements stables de plusieurs mois chez les rongeurs, bien que les implants aient été limités à 16 tétrodes dans une seule région. L’augmentation de la taille de l’implant microfilaire atteint une limite supérieure relativement élevée, avec jusqu’à 1792 canaux implantés atteints chez un primate non humain¹¹. Cependant, la construction des réseaux de microfils est incompatible avec les procédés de nanofabrication de silicium et prend donc énormément de temps, nécessitant une manipulation manuelle de chaque canal individuellement pendant la construction¹²^,¹³ ^,¹⁴. En tant que tel, il n’est pas clair si cette technologie pourrait soutenir une augmentation de l’ordre de grandeur des canaux d’enregistrement.

Les dispositifs actuels de silicium peuvent placer des centaines ou même plus d’un millier d’électrodes sur un seul dispositif monolithique¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Les derniers procédés de fabrication de silicium génèrent des dispositifs avec de plus petites zones transversales, indépendamment du matériau, résultant en moins d’activation glial²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^,²⁴ appareils et plus conformes. Il y a une variabilité dans les rapports de longévité d’enregistrement d’une seule unité de sonde de silicium, certains indiquant que les sondes de silicium relativement grandes peuvent fournir l’enregistrement à long terme²⁵^,²⁶. Notamment, les derniers dispositifs de silicium disponibles dans le commerce¹⁷ ont la longévité d’enregistrer pendant plusieurs mois et ont des zones transversales très similaires aux jarrets utilisés dans la méthode décrite ici (juin et al., 2017¹⁷: 70 m x 20 m, dispositifs décrits ici et dans Chung et al. 2019¹: 68 m – 80 m x 14 m). En raison de la différence de stabilité, cette sonde n’a pas été démontrée pour être en mesure d’enregistrer à partir des mêmes neurones au cours des semaines. Cela est probablement dû à une certaine combinaison de l’utilisation de silicium rigide ainsi que l’attache directe au crâne, connu pour causer la micromotion, l’instabilité et la gliose à l’interface tableau-cerveau²⁷^,²⁸. Pour construire un dispositif qui peut se déplacer avec le tissu neural, des matériaux qui sont doux⁵^,²⁹ et^{flexible 7} sont nécessaires. De nombreux polymères disponibles (voir Geddes et Roeder³⁰, Fattahi et coll.³¹, et Weltman et^{al. 32} pour les examens) ont la flexibilité et la stabilité des microfils et sont également compatibles avec les procédés de nanofabrication, qui permettent l’emballage dense des dispositifs de silicium.

Plusieurs problèmes d’implantation neuronale sont spécifiques à l’utilisation de réseaux d’électrodes polymères flexibles. Le premier d’entre eux est l’insertion du tableau, comme les tableaux flexibles n’ont pas la rigidité pour être avancé dans le cerveau comme le silicium ou microwire à base de stratégies. La majorité des stratégies d’insertion pour les dispositifs flexibles dépendent d’un raidissement temporaire du substrat comme c’est le cas dans cette méthode (voir Weltman et^al.32 pour examen). Il existe cinq stratégies notables qui ne font pas usage d’une navette rigide. Tout d’abord, il existe des méthodes qui font usage de matériaux qui passent de rigide à conforme à l’implantation³³^,³⁴. Un inconvénient de cette stratégie est qu’elle nécessite une zone transversale relativement grande pour atteindre la force requise pour la pénétration du tissu cérébral avant de boucler comme dictée par le calcul de force de boucle d’Euler³⁵. Cette augmentation de la zone transversale aura un impact négatif sur la santé des tissus environnants²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴. Deuxièmement, il faut utiliser une structure de soutien amovible au-dessus du cerveau^36,bien que cela nécessite un déplacement ou une dissolution de l’échafaudage pour maintenir une longueur minimale non supportée (et une force de boucle élevée). Alternativement, il faudrait que le tableau soit inséré avec une longueur non supportée plus longue, nécessitant ainsi un substrat de réseau plus rigide ou une plus grande zone transversale de réseau. Troisièmement, la pré-pénétration pour ouvrir un trou pour le tableau flexible à insérer dans la suite³⁵. Cela nécessite un réalignement précis ou un diamètre de pré-pénétration relativement important, ainsi qu’une rigidité du tableau d’électrodes et une zone transversale pour permettre une insertion non supportée. Quatrièmement, l’utilisation de revêtements dissolvables pour raidir l’appareil flexible. Cela augmente considérablement la zone transversale et les dommages aigus causés par l’insertion, même lorsque des précautions spéciales sont prises pour préserver la pointe pointue d’un dispositif³⁷. Cinquièmement, l’injection du tableau de polymère. Cette stratégie a réussi à réaliser des implants avec jusqu’à quatre insertions de 32 ch^2,mais nécessite l’utilisation d’une zone transversale beaucoup plus grande pour l’insertion, un tube capillaire en verre de 250 m et 1,5 mm de diamètre externe^9,causant des dommages plus importants. En revanche, l’utilisation d’une navette amovible, tout en ajoutant une zone transversale à l’insertion aigue, permet l’utilisation des matériaux les plus rigides possibles, et peut, par conséquent, être la taille minimale théorique lors de l’insertion d’un dispositif arbitrairement flexible. Ainsi, l’insertion à l’aide d’une navette rigide est actuellement l’option la plus attrayante pour l’insertion d’appareils flexibles.

Il y a deux exigences de toute approche de navette d’insertion : un substrat convenablement rigide et un moyen de coupler le dispositif flexible au substrat. Les matériaux de navette d’insertion sont typiquement silicium³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹, acier inoxydable⁸^,⁴², ou tungstène⁴³^,⁴⁴^, ⁴⁵, avec des matériaux plus rigides permettant de plus petites zones transversales. Ceux-ci sont généralement apposés à l’aide d’un adhésif tel que le polyéthylène glycol (PEG)⁸^,³⁸^,³⁹^,⁴²^,⁴³, forces électrostatiques⁴⁰, ou directe couplage physique⁴⁵^,⁴⁶. Dans tous les cas, les défis sont l’alignement et le couplage du tableau d’électrode et de la navette d’insertion avant l’insertion et le découplage après l’insertion. Il est ci-dessous un raffinement de la méthode introduite par Felix et coll.³⁹ pour atteler temporairement le réseau d’électrodes à une navette d’insertion de silicium, fixée à l’aide de PEG, qui est enlevée après l’insertion du tableau à sa profondeur cible.

Un deuxième défi présenté par les dispositifs flexibles au sein d’un implant chronique est celui de stabiliser l’appareil dans le cerveau tout en permettant à l’appareil d’être intégré dans un implant attaché au crâne. Le cerveau se déplace par rapport au crâne en raison de pulsations naturelles, des changements oedatifs post-traumatiques, l’impact, et d’autres causes, et le tableau d’électrode doit donc être au moins un peu libre de se déplacer par rapport à l’endroit où il est fixé au crâne et le matériel d’enregistrement. Ceci est réalisé à l’aide d’une pièce de base en plastique imprimée en 3D, conçue sur mesure pour chaque ensemble de cibles implantaires, qui a de multiples fonctions: un réservoir salin lors de l’implantation, l’emplacement pour attacher les tableaux de polymère, et le logement pour le gel de silicone. L’emplacement d’attache au-dessus du crâne et le gel de silicone travaillent ensemble pour créer un plus grand rayon de courbure pour le tableau et ainsi permettre de plus grandes forces compressives sur le tableau. Cela permet à son tour de se faire bouger du cerveau par rapport aux points d’ancrage du tableau (crâne) pour être traduit en charge de boucle.

D’autres défis incluent la nécessité d’abriter plusieurs tableaux et de fournir un soulagement de la souche ample pour l’animal de se comporter librement sans transfert de vibrations ou de forces d’impact aux réseaux d’électrodes, ce qui peut causer un mouvement par rapport au tissu neural. Les adaptations à des solutions qui ont été utilisées dans des applications similaires où le cerveau doit être stable par rapport à une fenêtre d’enregistrement rigide ont relevé ce défi. Un gel de silicone dural artificiel(Table of Materials), qui a déjà été démontré pour être non toxique et prévenir les fuites de CSF⁴⁷, fournit une contre-pression au cerveau pour prévenir l’enflure vers l’extérieur et de stabiliser le tableau à la surface du cerveau. Une couche supplémentaire de protection est ajoutée aux rubans de dispositif par l’élastomère chirurgical de silicone de qualité moyenne, précédemment démontré pour l’utilisation dans sceller les implants chroniques d’électrode neurale^48. Enfin, l’implant tamponné en silicone et la scène est encastré avec des pièces imprimées en 3D personnalisées conçues pour maintenir un centre de masse faible pour une réduction minimale de la mobilité normale de l’animal.

Ce protocole commence par un réseau de microélectrodes polymères flexible monté sur une navette d’insertion de silicium. Il procède avec le montage de l’appareil de tableau-navette aux pièces d’insertion 3D-imprimées, décrit la technique chirurgicale et les étapes de construction d’implant s’accumulent pour implanter avec succès un animal, et est capable de soutenir seize polymères multi-électrodes des tableaux implantés dans huit régions anatomiquement éloignées dans un seul rat¹.

Ce protocole suppose les matériaux de départ des tableaux d’électrodes de polymère attachés par le polyéthylène glycol (PEG) adhésif biodissoluble (PEG) à une navette d’insertion de silicium, comme indiqué dans Felix et al.³⁹, et au moins deux insertion mobile indépendante pièces : une à laquelle la navette en silicium sera collée et une à laquelle le connecteur du tableau d’électrode sera adhéré. Ce protocole utilise également une troisième pièce d’insertion pour attacher plus solidement les deux pièces d’insertion à un micromanipulateur à l’échelle d’un micron. Tous les fichiers pour l’impression 3D peuvent être trouvés à: https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts

Chaque réseau d’électrodes polymères, utilisé dans cette méthode, est composé de deux à quatre tiges d’enregistrement, d’un ruban qui transmet les traces électriques et, à l’extrémité du ruban, d’un connecteur matériel ou d’un circuit imprimé. Le tableau d’électrode et le ruban sont fixés au sommet de la navette en silicium avec PEG. Chaque ruban a un tube de polyimide de 2 cm de long x 1 mm d’épaisseur attaché au ruban par époxy curable UV, s’étendant perpendiculairement à la longueur duruban. Chaque appareil (réseau électrode et navette d’insertion) doit être chargé sur les pièces d’insertion imprimées en 3D qui seront utilisées pour insérer le tableau dans le cerveau et rétracter la navette (Figure 1). Dans cette conception, le micromanipulateur d’insertion hydraulique (vert, Table des Matériaux)déplace l’ensemble de l’appareil d’insertion (pièce 1, pièce 2 et micromanipulateur de rétraction, orange) à sa profondeur cible. Une fois que le tableau a été détaché de l’appareil d’insertion et fixé, le second, micromanipulateur de rétraction (orange) rétracte la pièce 1 et la navette jointe indépendamment du reste de l’appareil d’insertion, enlevant la navette sans déplacer le tableau.

Figure 1 : Composants de l’insertion.
(A) Les pièces 1 et 2 sont temporairement fixées l’une à l’autre avec une vis amovible et seront plus tard amarrées sur le piston micromanipulateur de rétraction (orange). (B) Le tableau et la navette d’insertion sont adhérés à la pièce 1 et le connecteur de tableau est fixé à la pièce 2 avec du ruban adhésif recto-verso. La pièce 3 relie le micromanipulateur de rétraction et les pièces 1 et 2 au micromanipulateur d’insertion (vert). Le micromanipulateur d’insertion est fixé à un adaptateur stéréotaxique pour le positionnement de l’implant. Les pièces 1-3 sont représentées dans leurs tailles relatives. La pièce 4 est une pièce stabilisante pour un alignement approprié de la navette d’insertion. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Protocol

Tous les protocoles destinés aux animaux décrits dans ce manuscrit ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UCSF. 1. Préparation de tableaux d’électrodes polymères pour l’insertion (30 min) Attachez la pièce 1 à la pièce 2 en insérant une vis à travers des trous alignés et orientés verticalement pour verrouiller les morceaux ensemble (Figure 2). Tenez ces deux pièces dans un vice. Attachez la bande recto-verso (Table of Materials) au sommet de la pièce 2. Fixer la pièce stabilisante 4 à la fin de la pièce 1. Il sera maintenu en place par friction. Figure 2 : Assemblage pour l’alignement de la navette de réseau.(A) Assemblage des pièces 1, 2, et pièce stabilisante en préparation de l’attachement de navette d’insertion. (B) Pièces 1 et 2 maintenues ensemble avec la vis du pouce. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. À la main, alignez le tableau d’électrode et attachez la navette d’insertion avec le segment étroit de la pièce 1. Lorsque la sonde est alignée avec l’axe longitudinal de la pièce 1, adhérez au connecteur de tableau au ruban double dénudé polyimide sur la partie plate de la pièce 2. Avec les forceps à pointe en plastique, en ne contactant que l’aile de polyimide attachée au ruban de tableau, soulevez l’extrémité de l’extrémité de tableau de navette-électrode d’insertion hors de la pièce 1, à l’extérieur de la pièce stabilisante (figure 3A). Appliquer une petite quantité de cyanoacrylate(Tableau des Matériaux)ou d’autres adhésifs (10 l) à l’extrémité de la pièce 1. Trop peu n’adhérera pas fortement à la navette d’insertion à la pièce 1, risquant le détachement pendant l’insertion ou la rétraction. Trop de risques de débordement de la navette et d’adhérer le tableau lui-même à la pièce 1. À l’aide de forceps à pointe en plastique, en ne contactant que l’aile polyimide attachée au ruban du tableau, réalignez l’appareil avec le segment étroit de la pièce 1, avec l’onglet carré de la navette d’insertion (et seulement la navette) au sommet de la colle (Figure 3B). Effectuez de petits ajustements d’alignement en manipulant le côté de la navette en silicium ou du PEG. Évitez d’appliquer une force excessive sur le ruban ou les jarrets. Figure 3 : Alignement, attachement et stérilisation de la navette de tableau.(A) Orientation appropriée du dispositif de tableau de navette-électrode d’insertion pour l’application de la colle sur la station d’amarrage de la pièce 1. Deux-shank tableau-navette montré. (B) Tableau d’électrode en polymère et navette d’insertion montée sur pièce d’insertion, avec pièce de stabilisation temporaire pour l’alignement. Deux-shank tableau-navette montré. (C) Dispositif d’insertion enfermé dans une boîte en plastique pour être protégé pendant la stérilisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Appliquer une légère pression vers le bas avec des forceps des deux côtés de la pièce stabilisante et retirez-la de l’assemblage sans déplacer le tableau. Retirez l’assemblage monté de l’appareil (pièces 1 et 2, tableau, navette d’insertion et connecteur de tableau) du vice et adhérez-le avec du ruban adhésif recto-verso à la base d’une petite boîte en plastique pour la stérilisation par oxyde d’éthylène (Figure 3C). La stérilisation à la vapeur n’est pas appropriée pour ces appareils. 2. Conception de la pièce de base Déterminer la taille de la craniectomie pour certaines cibles stéréotaxiques ainsi que l’emplacement des vis du crâne et des vis au sol. La taille de Craniectomy est déterminée par l’empreinte de tableau, avec quelques centaines (300) circonférence de micron pour des ajustements de placement pour éviter la vascularisation de surface. À l’aide d’un logiciel de conception (p. ex., CAO), concevoir l’empreinte de la pièce de base pour entourer les craniectomies prévues et s’adapter au périmètre défini par la crête temporelle et les vis du crâne, maximisant la surface du crâne qui sera à l’extérieur de la pièce de base à laquelle le ciment adhésif de luting peut se lier pour adhérer l’implant au crâne. Contour de la surface inférieure de la pièce de base afin qu’il puisse être adhéré au crâne sans lacunes, réduisant le risque d’infection et empêchant l’élastomère salin ou de silicone de s’infiltrer. Fixez la hauteur de la pièce de base à 3-7 mm, assez haut pour contenir l’élastomère salin et en silicone mais assez bas pour ne pas entraver la visibilité lors de l’insertion du tableau.REMARQUE : La pièce de base peut être conçue avec des poteaux verticaux ou des caractéristiques similaires auxquelles les ailes de polyimide peuvent être attachées à un point plus haut au-dessus du crâne. Ne laissez pas les points d’attache entraver la vue. Imprimez la pièce de base en 3D (Figure 4) et stérilisez la pièce de base avant l’implantation. Figure 4 : Crâne préparé pour l’implant.Durectomies avec vis de crâne, couche acrylique de base, et pièce de base fixée au crâne. 3. Préparation du crâne (2 h) Sélectionnez un rat de 400 g ou plus pour supporter le poids de l’implant. Des rats mâles de Long-Evans, à 6-12 mois d’âge ont été employés. Anesthésiez le rat. Placer l’animal dans une chambre d’anesthésie. Allumez 5% isoflurane. Injecter une dose intrapéritonéale de kétamine (50 mg/kg), de xylazine (6 mg/kg) et d’atropine (0,14 mg/kg). Surveillez la profondeur de l’anesthésie toutes les 20 min tout au long de la procédure en vérifiant qu’il n’y a pas de sevrage de la pince des pattes et que la fréquence respiratoire reste de 50 à 75 respirations/min. Appliquer la pommade pour les yeux sur le rat. Rase la tête du rat. Placez l’animal dans le support stéréotaxique. Préparer le site chirurgical en frottant avec trois gommages en alternance chacun de Povidone-iode gommage chirurgical, suivie d’une saline stérile. Injecter 0,2 cc de 0,5% de lidocaïne dans le cuir chevelu. Faire une incision sagittale à la ligne médiane du crâne exposant au moins 3 mm antérieur au bregma et 3 mm postérieur à la lambda. Retirer le périosteume à l’aide d’écouvillons de coton. Marquez les sites d’insertion et de craniectomy en marquant le crâne avec un scalpel utilisant un plan de coordonnées cartésiennes mis à zéro au bregma avec un instrument stéréotaxique. Percer les sites craniectomy, laissant une fine couche d’os qui peut être enlevée avec des forceps. N’exposez pas dura. Cela permet de nettoyer le crâne de la poussière osseuse sans perturber dura. Percer et insérer des vis osseuses, une à la fois, pour empêcher la poussière osseuse d’entrer dans les trous. Utilisez une irrigation isotonique généreuse pour enlever la poussière osseuse. Pour un implant d’environ 50 grammes, utiliser 10-12 vis. Les vis en titane permettent l’osseointégration49. Avancez les vis à une profondeur qui pénètre complètement le crâne sans avoir d’impact sur le cerveau. Connectez au moins une vis osseuse à un fil électriquement conducteur pour fonctionner comme un terrain de circuit. Après tout le forage est terminé, nettoyer le crâne de la poussière osseuse avec un lavage salin. Séchez le crâne avec des cotons-tiges ou d’autres absorbants et appliquez une couche initiale de ciment adhésif luting (Table of Materials) sur les vis (ne pas utiliser d’émail etchant sur le crâne de rongeur). Cette couche de ciment de luting adhésive préliminaire augmentera l’adhérence d’implant et diminuera le travail dans les étapes postérieures d’adhérence. Enlever la fine couche d’os restante à chaque craniectomy site. Incise dura à l’aide d’une aiguille de 30 calibres avec une pointe pliée tout en évitant toute vascularisation. La longueur de l’incision correspond aux dimensions de la navette d’insertion. En cas de saignement, irriguez manuellement avec un goutte-à-goutte salin doux et ne continuez pas jusqu’à ce que le saignement ait cessé. Si plusieurs contraintectomies sont effectuées, gardez les sites humides avec de la mousse de gel ou une autre méthode, comme l’irrigation régulière toutes les quelques minutes avec la saline à température corporelle. Séchez à nouveau le crâne avec des cotons-tiges ou d’autres absorbants en préparation pour l’adhérence de ciment de luting de la pièce de base au crâne. Placez la pièce de base stérile. Si la pièce de base couvrira le bregma, marquez un autre emplacement à une distance connue comme proxy. Appliquer du ciment adhésif luting autour du périmètre de la pièce de base. Remplir la pièce de base adhérente avec salin; identifier et corriger toute fuite avec du ciment adhésif à l’interface entre la pièce de base et l’interface du crâne (Figure 5).REMARQUE : Il est crucial que la pièce de base soit complètement fixée au crâne pour empêcher la fuite du gel artificiel de silicone de scellant dural, car ceci empêchera l’adhérence proportionnel de l’implant au crâne. L’animal est prêt à avoir des tableaux insérés. 4. Insertions en série de tableaux et de rétractions de navettes (1 h par tableau) REMARQUE : Cette procédure doit être mise à l’essai à l’égard d’un dispositif non viable, en particulier pour les implants à plusieurs tableaux où un appareil peut interférer avec l’implantation d’appareils ultérieurs. Chargez les pièces 1 et 2 sur le piston micromanipulateur de rétraction. Placez le micromanipulateur de la pièce 1 à une position étendue et le micromanipulateur de la pièce 3 à une position rétractée. Le piston glissera jusqu’à une profondeur terminale à l’intérieur de la pièce 1. La pièce 2 s’inscrit dans la partie supérieure de la pièce 3, avec les trous alignés. Chargez la pièce 3 sur le piston micromanipulateur d’insertion, et fixez-la en place avec une vis sur le dessous de la pièce 3 (Figure 5A,B). Chargez et vissent les pièces 2 et 3 ensemble, de sorte que le déplacement du micromanipulateur d’insertion déplace l’ensemble de l’appareil d’insertion (Figure 5C). Retirer la vis qui tient les morceaux 1 et 2 ensemble. La pièce 1 se déplace indépendamment de la pièce 2, pour permettre une rétraction séparée de la navette d’insertion de l’appareil. Insérez cette vis dans le trou latéral de la pièce 1, perpendiculaire à la voie du piston, jusqu’à ce que la vis exerce une pression sur le piston. Cela garantit que la pièce 1 se déplace en fonction du piston rétractable, comme on le voit dans la figure 5D. Assurez-vous de choisir le trou latéral qui n’entravera pas la vision lorsque l’appareil est monté sur l’instrument stéréotaxique. Figure 5 : Assemblage de l’insert.(A) Montage de la pièce 3 aux micromanipulateurs. (B) Attachement des pièces 1 et 2 sur l’appareil d’insertion. (C) Pièces d’insertion avec dispositif monté de navette d’insertion de tableau d’électrode. (D) La vis de pouce tenant la pièce 1 et 2 ensemble enlevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Retirer toute mousse de gel des craniectomies. Utilisez le bregma réel ou proxy pour le ciblage stéréotaxique. Lorsque vous déplacez l’appareil vers le site d’insertion, maintenez une hauteur d’au moins quelques centimètres au-dessus du crâne. Évitez les périodes prolongées de l’appareil de navette de tableau près du crâne ou du cerveau pour diminuer les chances que la condensation détache le tableau de la navette d’insertion avant ou pendant l’insertion. Si cela se produit, essayez d’élever le dispositif de tableau-navette haut au-dessus du cerveau et du crâne et attendre qu’il sèche et ré-adhère. Ajuster les coordonnées des implants pour éviter la vascularisation de surface. Comme pendant la craniectomy et la durcetectomie, évitez de pénétrer les vaisseaux directement. Insérez l’appareil rapidement (25 m/s), en abaissant avec l’instrument stéréotaxique jusqu’à ce que l’appareil pénètre dans le cerveau. L’appareil ne pénètre pas immédiatement dans le cerveau. Le degré de résistance et de fossette dépendra de l’emplacement de la cible et de la conception de l’appareil (p. ex., deux contre quatre jarrets, angle de pointe), mais la fossette ne dépasse généralement pas 1 mm (figure 6). Figure 6 : Insertion de la navette array.Array-shuttle est avancé dans le cerveau pour cibler la profondeur. Quatre-shank tableau-navette montré. Une fois dans le cerveau, plus bas avec micromanipulateur, diminuant la vitesse à l’approche de la profondeur cible: Utilisez le bras stéréotaxique pour commencer à insérer à 25 m/s. Utilisez le micromanipulateur pour insérer à 10 m/s lorsque 2 mm à 1 mm au-dessus de la profondeur cible. Insertion lente avec micromanipulateur à 5 m/s lorsqu’il s’est faut de 1 mm à 500 m au-dessus de la profondeur cible. Insertion lente plus loin à 1-2 m/s pendant les 500 ‘m finals à la cible. Visualisez les ailes de l’appareil (tubes en polyimide horizontal) et le point d’insertion lors de l’abaissement afin d’éviter le détachement prématuré de navette-array. Lorsque la profondeur cible a été atteinte (Figure 7A), ancrer bilatéralement les ailes de polyimide aux sites d’attachement de la pièce de base par l’intermédiaire d’acrylique curable léger ou d’un autre adhésif tel que le cyanoacrylate (Tableau des matériaux). Sécher, si nécessaire, les ailes ou le point d’attache sur la pièce de base, comme la condensation peut s’accumuler sur ces surfaces et prévenir l’adhérence. Si la visibilité ou d’autres contraintes d’espace l’exigent, l’ancrage à une seule aile de polyimide est généralement suffisant. Avant la dissolution, le PEG apparaîtra comme une masse globulaire assise au sommet de l’interface de la navette de tableau et d’insertion (Figure 7A). Dissoudre PEG en égouttant doucement la saline à température corporelle sur le tableau au point où elle est adhérée à la navette. La durée de cette période dépendra du poids moléculaire du PEG sélectionné et la dissolution complète peut être vérifiée par visualisation directe. Lorsque le PEG aura complètement dissous les limites des tableaux sera complètement discernable à partir de la navette et de la pièce 1 (Figure 7B). Figure 7 : Rétraction de la navette.(A) Tethering des ailes avant la rétractation. Tableau à deux tiges et navette montré. (B) Dissolution DE PEG et adhérence d’aile avec dispositif de tige (encerclé, bleu) qui permet la confirmation visuelle du découplage réussi du tableau et de la navette pendant la rétraction. (C) Une insertion réussie de tableau après la navette d’insertion a été rétractée. (D) Pièce de base avec gel de silicone se remplit pour une seule insertion de tableau à deux tiges. Le gel de silicone à faible viscosité utilisé a une teinte bleue. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. À l’aide du micromanipulateur de rétraction, retirez lentement la navette d’insertion. Poursuivre l’irrigation saline (1 goutte/s) sur le tableau en cours de rétractation. Utilisez des vitesses de rétraction qui sont les mêmes que la vitesse d’insertion à des distances pertinentes par rapport à la profondeur de la cible : Retirez-vous à l’aide du micromanipulateur à 1-2 m/s de la profondeur cible à -500 m. Accélérez la rétraction à l’aide du micromanipulateur à 5 m/s lorsque -500 m à -1 mm. Accélérez la rétraction à l’aide du micromanipulateur à 10 m/s lorsque -1 mm à -2 mm. Retirez-vous à l’aide du bras stéréotaxique à 25 m/s à partir de -2 mm de la cible et vers le haut. Visualisez l’interface entre le tableau et la navette d’insertion pendant la rétraction. Le réseau de polymères se séparera visiblement de la navette et apparaîtra translucide lorsque la navette sera rétractée à la jonction semi-circulaire entre les jarrets de la navette d’insertion (Figure 7B). Retirez le connecteur de tableau de la pièce 2 et déplacez-vous vers un emplacement qui n’interfère pas avec les insertions ultérieures. Le réseau d’électrodes polymères est maintenant dans le cerveau et n’est plus relié à l’instrument stéréotaxique (Figure 7C). Retirez la navette d’insertion et d’autres matériels d’insertion. Pour les insertions multiples, répétez les étapes 4.1-4.9; ne pas passer à la section suivante jusqu’à ce que tous les tableaux désirés soient insérés. Il est mal avisé d’insérer deux dispositifs à moins de 250 m l’un de l’autre, car le léger inclinaison du ruban de l’appareil entre le cerveau et les ailes dans la région de soulagement de la souche peut s’étendre au moins jusqu’à présent. 5. Construction d’implants (2 h) Après l’insertion finale du tableau, saline vide de la pièce de base à l’aide d’une pipette ou d’un coton-tige, en prenant soin de ne pas perturber les tableaux ou rubans implantés. Remplissez les craniectomies et la pièce de base avec de l’élastomère de silicone à faible viscosité, ou tout autre scellant dural artificiel. Laissez-le guérir (Figure 7D). Avec plusieurs insertions, placez les connecteurs matériels là où ils n’interfèrent pas (Figure 8A). Orientez convenablement les connecteurs de tableau, et construisez l’implant, ainsi les rubans sont dans leur position désirée finale. Couvrez les tableaux, les rubans et les connecteurs en élastomère en silicone à viscosité moyenne. Accordez une attention particulière à l’interface polymère-connecteur, car cette interface de matériau doux-dur est sujette à des dommages. Couvrez complètement les rubans de tableau de telle sorte que lorsque le silicone de viscosité moyenne guérit, ils sont immobilisés. Enfermer les dispositifs recouverts d’élastomère dans le boîtier conçu. Renforcer la base de l’implant avec de l’acrylique dentaire. Ne laissez pas l’acrylique entrer en contact direct avec les rubans de tableau parce que l’expansion de l’acrylique pendant qu’il guérit peut endommager les traces conductrices. Appliquer la bupivicaine et la pommade bacitracin autour de l’incision. Fermer l’incision à l’aide de 4-0 sutures en nylon et de la colle pour la peau. 6. Soins de récupération et d’implants Retirer l’animal de l’instrument stéréotaxique et le placer sur le côté sur un coussin chauffant. Donnez l’injection sous-cutanée de la solution chaude de Ringer (5 à 10 ml) pour hydrater l’animal. Une fois que l’animal est locomoting (10 à 60 min), transférer dans une cage avec la moitié de la cage sous un coussin chauffant à 37 oC pendant 2-3 jours. Sous un coussin chauffant, donner accès à de la nourriture et de l’eau ramollies. Injecter à l’animal 2 mg/kg de Meloxicam toutes les 24 h (administration sous-cutanée ou orale) pendant 1 semaine au besoin pour le contrôle de la douleur. Laisser le rat 1-2 semaines pour guérir et s’ajuster au poids de l’implant (Figure 8B). Effectuer le lavage régulier de chlorhexidine du tissu autour de l’implant et l’inspection quotidienne pour l’irritation, l’infection, ou la déhiscence. Figure 8 : Plusieurs tableaux insérés et rat après récupération de l’implantation. (A) Connecteurs matériels dans des endroits pour ne pas interférer avec les insertions ultérieures. (B) Un implant à 1 024 canaux, un réseau de polymères chroniques. Reproduit avec la permission de Neuron [Figure supplémentaire 1H]1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Representative Results

Suite à ce protocole, un enregistrement d’implant neuronal de 1 024 canaux a donné 375 unités simples1 (triées avec MountainSort50, le chevauchement de bruit ‘lt; 0.03, isolation ‘gt; 0.96, 512 canaux utilisés pour l’enregistrement d’une seule unité, Figure 9A). Ce protocole peut être utilisé pour implanter différents nombres d’appareils, avec différents nombres de canaux et spécifications, à différentes combinaisons de cibles d’enregistrement. En utilisant le même protocole, la longévité d’enregistrement d’une seule unité a été démontrée pendant au moins 160 jours1 dans les données de 19 dispositifs (18 dispositifs de 32 canaux dans les cortices préfrontaux, un dispositif de 64 canaux dans le cortex orbitofrontal) à travers trois rats différents ( Figure 9B). L’un des trois animaux a subi une panne électrique numérique, ce qui a entraîné l’incapacité d’enregistrer à partir de quatre appareils. Sur les 15/19 appareils restants, il y avait une moyenne de rendement d’enregistrement de 1 unité unique par canal. Les appareils individuels n’avaient des rendements que de quelques unités individuelles jusqu’à 2 unités par canal. Il est typique de voir des rendements très différents sur les dispositifs implantés dans le même animal dans la même région. En outre, une équipe chirurgicale différente suivant le protocole décrit ici a implanté six animaux additionnels chacun avec une combinaison de 4-6 dispositifs 32 canaux visés au cortex orbitofrontal et aux accumbens de noyau, et d’un hyperdrive de tétrode (implant total d’environ 50 g). Un animal a eu un implant se détacher dans un mois de la chirurgie. Un deuxième animal est mort pendant la période de rétablissement postopératoire, probablement sans rapport avec les étapes de protocole décrites ici. Les quatre autres animaux sont restés en bonne santé avec des implants stables que pour la durée de l’expérience, qui a duré 4-11 mois. Le nombre d’unités uniques était semblable à celui signalé précédemment pour les appareils à 32 canaux. Figure 9 : Rendement d’une seule unité et longévité enregistrant.(A) Nombre de grappes d’unité unique présumées provenant de 512 canaux (sur l’implant de 1 024 canaux), stratifiés par des seuils métriques de qualité. La curation automatisée à l’aide de MountainSort (bruit se chevauche0,03, isolation 0,96, boîte noire en haut à droite) a permis d’identifier 375 unités uniques des 512 canaux. Reproduit avec la permission de Neuron [Figure 2A]1. (B) Rendements unitaires pour les réseaux de polymères par canal (axe y gauche) ou par tige de 16 canaux (axe y droit) sur 160 jours après l’implantation (axe X) chez les rats. La ligne solide est le rendement cellulaire moyen à travers 8 tiges, lignes pointillées – 1 SE. Les points de temps individuels par tige sont indiqués comme points de couleur par région. Reproduit avec la permission de Neuron [Figure 3A]1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Il s’agit d’une méthode pour l’implantation de plusieurs réseaux d’électrodes polymères dans des zones cérébrales distribuées pour l’enregistrement d’unités uniques sur des mois. Cette méthode représente une augmentation de 8 fois des canaux d’enregistrement et une augmentation de 4 x 4 fois du nombre d’insertions du système à grande échelle à large échelle basé sur le polymère²^,³. Ce système a utilisé un système à base d’injection de maille de polymère chez la souris, mais n’a pas signalé un nombre absolu d’unités uniques putatives et donc une comparaison du rendement unique de neurone n’est pas possible.

La méthode d’insertion d’un dispositif flexible est basée sur un protocole antérieur de Felix et coll.³⁹, avec des modifications importantes : un appareil d’insertion en trois pièces pour le mouvement indépendant de la navette en silicium pendant la rétraction, et l’attache du tableau à sa profondeur cible avant la rétraction de la navette, qui, ensemble, éliminent la nécessité du retrait rapide décrit dans le protocole original. Ces changements minimisent les dommages aux tissus et maintiennent la stabilité du tableau pendant la rétraction de la navette. D’autres stratégies d’implantation d’appareils flexibles, telles que des dispositifs de raidissement temporaire avec des matériaux bio dissolvables, sont compatibles avec les étapes ultérieures de ce protocole. La sécurisation des dispositifs à l’intérieur de l’implant nécessitait l’intégration de stratégies préalablement validées pour couvrir le cerveau et protéger les rubans délicats de l’appareil.

En raison de leur fragilité, il faut prendre soin et attention pour éviter de contacter directement ou de transmettre autrement la force aux réseaux d’électrodes polymères et aux navettes d’insertion de silicium. Particulièrement lorsque vous travaillez avec plusieurs appareils, l’insertion doit être observée au microscope pour éviter les interférences d’un appareil avec un autre. En général, il est possible de manipuler un réseau d’électrodes doucement avec des forceps à pointe en plastique, en évitant les traces. Une telle stratégie est appropriée, par exemple, si le réseau d’électrodes de polymère commence à se rétracter avec la navette d’insertion. Cela peut se produire si le PEG n’est pas complètement dissous, ou en raison de la tension de surface de la saline ou CSF entre le polymère et le silicium.

L’une des erreurs récupérables les plus courantes est le détachement de tableau de la navette d’insertion. Cela peut se produire à l’insertion, comme les fossettes du cerveau et la pression à la pointe de l’appareil augmente, si le tableau et la navette sont imparfaitement alignés ou si la condensation a partiellement dissous le PEG. Pour ré-adhérer à un tableau, soulevez-le le plus haut possible au-dessus de la surface du cerveau et attendez qu’il sèche (environ 5 min).

Un aspect critique de la planification d’une chirurgie d’implantation multi-array est la conception de la pièce de base pour accueillir toutes les cibles implantaires et s’asseoir sans lacunes contre le contour du crâne. La pièce de base est une petite pièce en plastique qui est fixée au crâne après le nettoyage du crâne, le placement de vis, et les craniectomies partielles, avant l’insertion des tableaux. Il a trois fonctions : 1) pour tenir saline pour dissoudre l’insertion suivante de tableau de PEG mais avant la rétraction de navette de silicium, 2) pour fournir un emplacement au-dessus de la surface de crâne à laquelle les tableaux peuvent être attachés par des ailes de polyimide, permettant ainsi le soulagement de contrainte le long du ruban au-dessus de son point d’insertion dans le cerveau, et 3) pour tenir le scellant dural artificiel, qui stabilise et protège les tableaux et le cerveau. La pièce de base peut être façonnée à la main ou imprimée en 3D. Il a été observé que le drainage et le séchage de la pièce de base de saline sont très importants avant l’insertion de l’appareil. Ces étapes empêchent la condensation et la séparation du tableau et de la navette d’insertion. Le séchage de la pièce de base est également essentiel pour remplir la pièce de base avec un scellant dural artificiel. Il est également important que la pièce de base ne fuit pas, comme un film de gel de silicone est difficile à enlever du crâne et permettra d’éviter l’adhérence de l’acrylique dentaire pour l’attachement chronique fiable de l’implant au crâne. On s’attend à ce que n’importe quel élastomère de silicone biocompatible et à faible viscosité puisse être employé pour remplir les craniectomies et la pièce de base, avec un élastomère de silicone de viscosité plus élevé l’entourant et les rubans exposés de tableau de polymère.

Les progrès de la nanofabrication de polymères se traduiront par des réseaux d’électrodes à base de polymères, réduisant la taille des entités et augmentant le nombre possible d’électrodes dans un réseau plus proche de ceux des dispositifs de silicium¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ ^,¹⁸^,¹⁹. De même, les zones transversales des dispositifs polymères se rétréciront à côté de la taille des entités, offrant une biocompatibilité encore meilleure⁸. Encore une fois, comme cela se fait avec les dispositifs de silicium, l’intégration avec l’amplification, la numérisation et le multiplexage des puces¹⁷ permettra davantage l’enregistrement neuronal à plus grande échelle.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la subvention NINDS U01NS90537 à L.M.F et V.M.T., la subvention du NIMH F30MH109292 à J.E.C. et la subvention du NIMH F30MH115582 à H.R.J. J.E.C. et H.R.J. sont également appuyées par nigMS MSTP #T32GM007618. L’Institut Flatiron est une division de la Fondation Simons.

Materials

3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1)	N/A	N/A	3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at:
	N/A	N/A	https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts
Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set)	Colten/Whaledent	8886784, 8881627	Dental acrylic for use during implant construction
Hydraulic Micromanipulator (x2)	Narishige Group	MO-10	1-axis micromanipulator
Kapton Polyimide Tape	Bertech	PPTDE-1/2	Double-sided tape
Kopf Stereotax Arm	Kopf Instruments	103088R, 103088L	Standard rodent stereotax
Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow	Coltene/Whaledent	D33-01-00	Light curable dental acrylic for use during implant construction
Loctite Gel Control	Henkel Corp.	234790 1364076 1735574 1752699	Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part
Metabond Quick Cement	Parkell	S380	For direct application to skull to create strong connection between skull and implant
Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles	Lawrence-Livermore National Laboratory	N/A	Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle
Silicone Gel Kit, Low Viscosity	Dow Corning	03/80	Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece
Silicone, Medium-Viscosity Kit	World Precision Instruments	Kwik-Sil	Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays

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Flexible Polymer Electrode Arrays Chronic Implantation Multi-region Recording Long-term Recording Neuronal Population Monitoring Insertion Device Alignment Adhesive Micromanipulator

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Chung, J. E., Joo, H. R., Smyth, C. N., Fan, J. L., Geaghan-Breiner, C., Liang, H., Liu, D. F., Roumis, D., Chen, S., Lee, K. Y., Pebbles, J. A., Tooker, A. C., Tolosa, V. M., Frank, L. M. Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays. J. Vis. Exp. (152), e59957, doi:10.3791/59957 (2019).