Un virus de la gripe Reportero fluorescente de Luciferase para imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral

Todos los protocolos relacionados con ratones han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad de Rochester, Facultad de Medicina y Odontología. Todos los experimentos realizados en animales siguen las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación58. El Vivarium y la División de Instalaciones de Medicina Animal de Laboratorio en la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Rochester está acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado Animal de Laboratorio (AALAC) Internacional y cumplir con las leyes federales y estatales y la política de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Se requiere un equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando se trabaja con ratones. Se deben implementar políticas y requisitos similares al realizar experimentos descritos en este manuscrito en cada institución. 1. Uso de pequeños animales vertebrados Comprar ratones BALB/c hembra de cinco a siete semanas de edad y mantenerlos en el centro de cuidado animal en condiciones específicas libres de patógenos. A la llegada de los ratones a las instalaciones determinadas, permita un período de descanso de 4 a 5 días para permitir que los animales se aclimaten a su nuevo entorno. Siguiendo los protocolos IACUC, coloque un máximo de 5 ratones por jaula.NOTA: Al concluir el experimento, con el fin de garantizar que el animal está muerto, los ratones fueron eutanasiados utilizando dos procedimientos aprobados, teniendo en cuenta que el segundo debe ser un método físico. En este estudio, después de la infección por ratones con BIRFLU y la toma de imágenes in vivo, los animales se eutanasian con una dosis letal de 2,2,2-tribromoetanol (TBE), y cortando la vena hepática como método secundario físico como hemos demostrado previamente23. 2. Bioseguridad NOTA: En este manuscrito, BIRFLU se generó en la columna vertebral de la gripe A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), que es una cepa IAV de laboratorio común adaptada al ratón23,32,33,56. El virus se generó utilizando enfoques de genética inversa descritos anteriormente basados en plásmidos y una descripción completa de la generación, y la caracterización in vitro e in vivo de BIRFLU se puede encontrar en nuestra reciente publicación55. Todos los procedimientos que involucran infecciones por ASI (in vitro o in vivo) se realizaron en un gabinete de seguridad biológica en condiciones de nivel de bioseguridad (BSL)-2. PRECAUCION: Debe determinarse un nivel adecuado de bioseguridad de conformidad con una evaluación del riesgo de bioseguridad. Deberá consultarse con la institución en la que se realizarán los experimentos información adicional sobre la realización de evaluaciones del riesgo de seguridad de la bioseguridad y el establecimiento de una contención eficaz de la seguridad de la biotecnología. Limpie los gabinetes de bioseguridad con un 70% de desinfectante de etanol o dióxido de cloro antes y después de realizar todos los procedimientos experimentales. Para el trabajo en ratones, esterilizar todo el material de disección (tijeras, fórceps de disección, etc.) y el homogeneizador Dounce antes y después de su uso. Deseche todo el material biológico producido durante los procedimientos bajo las directrices apropiadas de IBC e IACUC. 3. Caracterización in vitro de BIRFLU (Figura 2) NOTA: Refiera al cuadro 1 para todas las composiciones del buffer y de los medios. Analizar la expresión proteica por fluorescencia (Figura2A)e inmunofluorescencia indirecta (Figura 2B) Un día antes de la infección, sesemilla placas de 24 pocillos con células epiteliales madin-darby canino riñón (MDCK) (1 x 105 células/pozo, triplicados) en medios de cultivo de tejido y mantener las placas en una incubadora de 37 oC con 5% de CO2. Preparar suficientes pozos para evaluar todos los anticuerpos elegidos en células infectadas por simulacros y infectadas por BIRFLU.NOTA: Recomendamos visualizar las células bajo un microscopio ligero para confirmar una monocapa antes de iniciar la infección viral. Se recomienda una monocapa de confluencia del 90% de células MDCK en el momento de la infección. Preparar diluciones de IAV de WT o BIRFLU en medios de infección e infectar las células MDCK sembradas con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 unidades formadoras de placa (PFU) por célula en un volumen final de 0,25 ml/pozo de medios de infección. Retire el medio de cultivo de tejido del paso 3.1.1 y lave las células MDCK dos veces con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS). Agregue las diluciones del virus de 3.1.2 a las células MDCK y coloque las placas en una plataforma de balanceo durante 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral.NOTA: Las células infectadas por la burla se incuban solo con medios de infección en ausencia de virus. Después de la adsorción viral (paso 3.1.3), retire el inóculo viral por aspiración y agregue 1 ml de medios post-infección que contengan 1 g/ml de trippsina tratada con TPCK a cada poc. Incubar células durante 18 h en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 33oC. Después de 18 h de infección, retire el sobrenadante de cultivo de tejido de las placas de 24 pocillos (3.1.4). Fijar y permeabilizar las células con 0,25 ml/pozo de solución de fijación/permeabilización durante 20 minutos a temperatura ambiente.NOTA: Prepare la solución de fijación/permeabilización en una campana de humo sin humos para evitar la exposición al formaldehído. Retire la solución de fijación/permeabilización del paso 3.1.5, lave las células dos veces con 1pbS e incubar las células con 0,25 ml/bien de solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.NOTA: Continúe con el siguiente paso o almacene las celdas en solución de bloqueo a 4 oC durante la noche. Retire la solución de bloqueo (paso 3.1.6) y agregue 0,25 ml/pozo (1 g/ml) de un anticuerpo monoclonal de ratón (MAb) contra la nucleoproteína IAV, NP (HB-65) o una dilución de 1:1.000 de un anticuerpo policlonal de conejo (pAb) contra NLuc (ver la Tabla de Materiales), ambos diluidos en solución de dilución de anticuerpos (1x PBS, 2,5% BSA), e incubar las células durante 1 h a 37 oC. Retire el anticuerpo primario del paso 3.1.7, lave las células tres veces con 1x PBS e incubarlas con 0,25 ml/bien de un antiratón conjugado en rojo de Texas o anticuerpos secundarios anticonejo (ver la Tabla de Materiales)diluido 1:200 en anticuerpos solución de dilución.NOTA: Los núcleos celulares se pueden teñir al mismo tiempo añadiendo 0,5 g/ml de 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a la misma solución secundaria de anticuerpos. Incubar las células durante 1 h a 37 oC en la oscuridad. Se pueden utilizar otros anticuerpos secundarios conjugados con otros fluoróforos. Retire el anticuerpo secundario y el DAPI del paso 3.1.8, lave las células tres veces con 1 x PBS. Después del lavado, deje las células en 0,25 ml/pozo de 1pbS. Coloque la placa en el escenario de un microscopio de fluorescencia para detectar la expresión del reportero de Venus y Nluc, y NP de células infectadas utilizando los filtros fluorescentes adecuados. Capture imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia (aumento de 20x) y combínelas utilizando un software de edición de imágenes (Figura2A,B). Analizar la actividad Nluc (Figura2C)y la replicación viral (Figura2D). Un día antes de la infección, las placas de 12 pocillos de semilla con células MDCK (2 x 105células/pozo, triplicados) utilizan los medios de cultivo de tejido en una incubadora de 37 oC con 5% de CO2 para alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia en el momento de la infección.NOTA: Antes de la infección, revise las células bajo un microscopio para verificar una monocapa de células MDCK. El día de la infección preparar diluciones de los virus WT y BIRFLU en los medios de infección para infectar las células MDCK (paso 3.2.1.) en triplicado con un MOI de 0.001 PFU en 0.5 mL/pozo. Retire el medio de cultivo de tejido y lave las células MDCK dos veces con 1 pbS. Añada las diluciones del virus a las monocapas MDCK y permita la adsorción viral a temperatura ambiente durante 1 h en una plataforma de balanceo. Después de la adsorción viral, eliminar el inóculo del virus y añadir 1,5 ml de medios post-infección que contengan 1 g/ml de trippsina tratada con TPCK, a cada poca. Incubar las células infectadas en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 33 oC y recoger los sobrenadores en los puntos de tiempo indicados en el paso 3.2.4. A las 24, 48, 72 y 96 h después de la infección (p.i.) recoger 150 l de sobrenadante de cultivo tisular de cada pocal y almacenar las muestras en un tubo de microcentrífuga a -80 oC para realizar los ensayos de Nluc y las valoraciones virales. Para realizar el ensayo de actividad Nluc, siga las indicaciones del fabricante. En primer lugar, descongelar el sobrenadante de cultivo de tejido almacenado a -80 oC (paso 3.2.4) sobre hielo.NOTA: Consulte las recomendaciones del fabricante y optimice el ensayo si es necesario. Preparar la solución de ensayo de luciferasa (ver la Tabla de Materiales)diluyendo el sustrato nluc 1:50 con el tampón de dilución. En una microplaca blanca de fondo plano de 96 pocillos para ensayos de luciferasa, mezcle 25 ml de solución de ensayo de luciferasa con 10 a 25 l de las muestras de sobrenadantes de cultivo de tejido recogido. Incubar la mezcla durante 2-3 minutos antes de medir la luminiscencia utilizando un luminómetro (Figura2C).NOTA: La presencia de partículas virales infecciosas en los sobrenatantes del cultivo de tejidos se determina mediante ensayo de enfoque inmune por fluorescencia (Venus) o inmunofluorescencia indirecta (tinción de antígeno sórmicos virales) como se describió anteriormente23,32, 33,56. Un día antes de las valoraciones virales, las células MDCK de semillas en una placa de 96 pocillos (2 x 104 células/pozo, triplicados) con medios de cultivo de tejido y permiten que las células alcancen una confluencia del 90% en el momento de la infección en una incubadora establecida a 37 oC con 5% de CO2. Utilice las muestras de sobrenadantes de cultivo de tejidos que se descongelaron sobre hielo (paso 3.2.4.). Añadir 90 l de medios de infección a cada uno de los pozos en una nueva placa de 96 pocillos, luego añadir 10 l del sobrenadante de cultivo de tejido descongelado (paso 3.2.4) al primer pozo (fila A). Utilice una tubería multicanal para mezclar y transferir 10 l de la fila A a la fila B. Cambie las puntas entre las diluciones y mezcle bien.NOTA: Este procedimiento debe repetirse hasta la última fila (H). Recomendamos realizar valoraciones virales en triplicados para una medición precisa de los valoradores virales. Retire el medio de cultivo de tejido de las células MDCK en las placas de 96 pocillos (paso 3.2.7) y lávelo dos veces con 1 pbS. Añadir 50 l de las diluciones de sobrenadantes de la réplica placa de 96 pocillos que contiene las diluciones del virus (paso 3.2.8) a cada pocto en la placa de 96 pocillos que contiene células MDCK. Incubar la placa de 96 pocillos en una plataforma de balanceo durante 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral. Después de la adsorción viral, retire el inóculo y agregue 100 l/pozo de medios post-infección que contengan 1 g/ml de trippsina tratada con TPCK. Incubar células infectadas durante 12 h en una incubadorade 33 oC con 5% de CO2. Dado que BIRFLU expresa Venus, el número de células infectadas se puede contar directamente mediante un microscopio de fluorescencia. Alternativamente, los títulos virales pueden determinarse mediante inmunofluorescencia indirecta como se describió anteriormente utilizando un anticuerpo contra una proteína viral23,56,57,59. Para este último, proceda a fijar/permeabilizar las células y la mancha utilizando el anti-NP mAb HB-65 como se describe en la sección 4.4. Determinar los lanzadores virales contando el número de unidades formadoras de fluorescentes (FFU)/ml utilizando la fórmula: ((número de FFU) x 20 x 1/dilución (Figura 2D). 4. En Vivo Caracterización de BIRFLU (Figura3 y Figura 4) Infección del ratónNOTA: La infección intranasal de ratones se realizó como se describió anteriormente23. Para un protocolo más detallado de la infección por IAV in vivo utilizando el modelo de ratón de infección, recomendamos ver el vídeo asociado con la publicación anterior23. Esta sección sólo resume los pasos necesarios para la infección del ratón con BIRFLU. Inspeccione a los ratones para evaluar su salud y su aspecto físico general. Preparar la dilución de BIRFLU en 1x PBS para inocular ratones con 1 x 106 PFU de BIRFLU en un volumen total de 30 l/ratón. Mantenga el virus sobre hielo hasta la inoculación del ratón.NOTA: Se necesitarán ratones infectados por la burla (1x PBS) como control interno para la toma de imágenes. Coloque ratones infectados por simulacros en una jaula diferente a la de los animales infectados por BIRFLU. Anestetizar ratones BALB/c hembra de cinco a siete semanas de edad por vía intraperitoneal con 240–250 mg/kg de tribromoetanol (TBE) insertando la aguja en el caudal 2/3 del lado derecho del abdomen. A continuación, devolver el ratón a la jaula y esperar alrededor de 5 min. Compruebe que el ratón está anestesiado antes de la inoculación del virus por la ausencia del reflejo del dedo del pie-pinch.NOTA: Se recomiendan sedantes inyectables sobre sedantes inhalados para infecciones gripales in vivo, ya que estos últimos pueden modificar el comportamiento y la toma del virus por el epitelio de las vías respiratorias. Además, también pueden afectar las respuestas inmunitarias locales del pulmón e interferir con la imagen in vivo de ratones infectados. Por último, los sedantes inhalados han reducido la duración del efecto, lo que sería un problema para la toma de imágenes in vivo de los animales infectados. Inocular los ratones por vía intranasal con los 30 ml de la dilución BIRFLU preparada. Compruebe que los ratones respiran correctamente antes de devolverlos a la jaula. Monitorización de la bioluminiscencia de ratones infectados con BIRFLU (Figura 4A)NOTA: En este manuscrito se determinan la expresión de reportero de Nluc o Venus y la replicación viral en los pulmones de ratones infectados con BIRFLU a los 3 días posteriores a la infección. Sin embargo, la naturaleza de las imágenes de bioluminiscencia permite un seguimiento repetido de la expresión de Nluc en animales individuales infectados por BIRFLU sin necesidad de eutanasiarlos para cada punto de tiempo experimental. Se requiere un sistema de diagnóstico por imágenes in vivo con un colector de anestesia isoflurano para realizar los procedimientos experimentales descritos. Consulte la Tabla de materiales para obtener más información sobre el instrumento de imagen y el software de imagen utilizados para la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Afeitar el pecho de los ratones para mejorar la señal de bioluminiscencia. Abra el software de imágenes y pulse Inicializar. A continuación, establezca los parámetros que se utilizarán, incluyendo el ajuste del modo de imagen a bioluminiscencia, ahorro automático, tiempo de exposición a automático, filtro abierto, etc. Una vez que la máquina esté completamente inicializada, encienda el sistema de anestesia de isoflurano. Coloque los animales en la cámara de anestesia. Los ratones son anestesiados simultáneamente y ligeramente con una mezcla de gas de oxígeno y vaporizados 1–2% de isoflurano. Una vez anestesiados los ratones, administre el sustrato de Nluc (ver la Tabla de Materiales)diluido 1:10 en 1x PBS (volumen final 100 l/ratón) por vía retroorbital utilizando una jeringa con una aguja de 22 G. Inmediatamente después de la administración del reactivo Nluc, coloque los animales en el instrumento de imágenes con los pechos hacia arriba y hacia fuera dentro del cono del colector para mantener al animal anestesiado durante la toma de imágenes. Inmediatamente después de cerrar la puerta del imager, haga clic en Adquirir en el programa de software (Figura4A,superior). Después de la toma de imágenes, devuelva a los ratones a sus jaulas monitorizándolos hasta que se hayan recuperado por completo y apague el vaporizador de isoflurano. A continuación, proceda con la toma de imágenes ex vivo de los pulmones de ratones para evaluar la expresión génica del reportero de Venus (sección 4.3). Utilice las herramientas de software de imágenes para analizar los datos de bioluminiscencia adquiridos. Utilice el ROI de la herramienta (región de interés) para designar la señal específica y realizar mediciones de flujo en la región de interés (normalmente alrededor del pecho) (Figura4A,inferior). Aunque la forma del ROI es irrelevante, generalmente se prefieren los ROI más grandes para capturar toda el área de difusión de la señal. Haga clic en Medir. Evaluar la bioluminiscencia en fotones ya que proporciona una medición absoluta de emisión de fotones que es comparable a las mediciones de salida proporcionadas por diferentes parámetros o instrumentos de imagen. Análisis de fluorescencia en ratones infectados con BIRFLU (Figura3 y Figura 4B) Recoger los pulmones del ratón después de la toma de imágenes in vivo, como se describió anteriormente23. Brevemente, eutanasia ratones con una dosis letal de TBE (500 mg/kg). Desinfectar el lugar de la incisión con 70% de etanol. Con un bisturí, haga una incisión desde el esternón hasta la base del abdomen y luego corte desde la parte inferior de la incisión a los lados con tijeras. A continuación, corte la vena hepática (segundo método de eutanasia física) para sangrar al animal.NOTA: Para evitar una señal de fondo alta durante la toma de imágenes, es importante minimizar la cantidad de sangre en los pulmones (ver más abajo). Coloque el ratón en la recumbencia dorsal y use las tijeras para cortar la pleura y abrir la caja torácica. Posteriormente, retire los pulmones cortando el extremo de la tráquea con tijeras mientras sostiene suavemente los pulmones con fórceps. Coloque los pulmones en una placa de seis pocillos con 2 ml de 1pbS y lave los pulmones tres veces con 1 x PBS.NOTA: Para evitar la contaminación entre muestras, limpie y desinfecte las herramientas de diselación entre cada animal. Inicie el software de adquisición de imágenes haciendo clic en inicializar y establecer los parámetros para la imagen, incluyendo la configuración del modo de imagen a fluorescencia, ahorro automático, tiempo de exposición a los filtros automáticos, excitación (500 nm) y emisión (540 nm). Cuando se inicialice la máquina, coloque los pulmones en una bandeja de fondo negro, asegurándose de que los tejidos estén separados entre sí, introduzca la bandeja en el imager y haga clic en Adquirir en el programa del sistema de imágenes después de cerrar la puerta del imager ( Figura 4B,superior). Después de la toma de imágenes, retire los tejidos inmediatamente y guárdelos en hielo (4 oC) si las muestras se procesan el mismo día; o en un tubo y hielo seco para congelarlos rápidamente, antes de almacenarlos a -80 oC, si las muestras se procesarán más tarde en un día diferente. Para el procesamiento de imágenes, seleccione la herramienta ROI y dibuje ROI alrededor de cada uno de los pulmones individuales. Haga clic en Medir. A continuación, utilizando las mediciones de eficiencia radiante media resultantes, reste los valores de los ratones infectados por el simulacro (Figura4B,inferior).NOTA: Con BIRFLU, hay una buena correlación de los niveles de expresión de Nluc y Venus, y la distribución de la señal. Por lo tanto, es importante analizar la expresión Nluc (ratón entero) y Venus (pulmones extirpados) del mismo animal, y mantener la misma orientación. Evaluación de la replicación de BIRFLU en pulmones de ratones (Figura 3 y Figura 4C) Homogeneizar los pulmones de ratones para la valoración viral por ensayo de placa como se describió anteriormente23. Coloque los pulmones en un homogeneizador Dounce con 1 ml de medios de infección refrigerados. Homogeneizar los pulmones con el pestillo durante 1 min a temperatura ambiente hasta que se haya desintegrado por completo y almacenar las muestras en un tubo estéril a 4oC. Centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante en un tubo estéril. Almacene las muestras en hielo si se utilizarán el mismo día o congele a -80 oC para evaluar los lanzadores virales más adelante.NOTA: Se debe utilizar un nuevo homogeneizador Dounce para cada muestra de pulmón. Para realizar el ensayo de placa, el día antes de realizar la valoración viral, las placas de seis pocillos de semilla con células MDCK (5 x 105 células/pozo) en los medios de cultivo de tejido. Incubar las células durante la noche a 37 oC con un 5% de CO2 para alcanzar el 90% de confluencia al día siguiente. Antes de la infección, confirme que las células forman una monocapa bajo un microscopio de luz. Preparar las diluciones en serie 1:10 del sobrenadante a partir de las muestras homogeneizadas (paso 4.4.1) en los medios de infección. Preparar tubos de microcentrífuga con 540 ml de medios de infección, añadir 60 ml de la muestra de pulmones homogeneizados al primer tubo, mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y luego usando una nueva punta, transferir 60 s al siguiente tubo. Repita este proceso de dilución en serie hasta la última dilución.NOTA: En nuestra experiencia 7 diluciones son suficientes para determinar los tituladores virales por ensayo de placa de los pulmones de ratones infectados. Lave las células MDCK (paso 4.4.3) dos veces con 1pbS y transfiera 500 l de las muestras diluidas en serie a cada pocal de la placa de seis pocillos. Coloque las placas sobre una plataforma de balanceo y permita que se produzca una absorción viral durante 1 h a temperatura ambiente. Después de 1 h de absorción viral, eliminar el inóculo viral, añadir 2 ml/pozo de medio de superposición que contenga 1 g/ml de trippsina tratada con TPCK y, a continuación, incubar las células a 33 oC por debajo del 5% de CO2 durante 3 días. Fijar las células infectadas (paso 4.4.6) con 1 mL/pozo de 4% de formaldehído diluido en 1x PBS a temperatura ambiente durante 2 h, luego quitar cuidadosamente el medio de superposición y añadir 1 mL de 1x PBS a cada pocto. Para la visualización de Venus, ilumine las placas de seis pocillos con un sistema de imágenes para la detección de fluorescencia.NOTA: Las placas virales se pueden colorear utilizando un software de edición de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Para evaluar la expresión de Nluc, visualice las placas virales mediante inmunomancha utilizando un pAb anti-Nluc. Para ello, retire el 1x PBS, permeabilize las células usando 0.5 mL/pozo de solución de permeabilización durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución de permeabilización, lave las células tres veces con 1pbS y bloquee con 0,5 ml/pozo de solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Retire la solución de bloqueo del paso 4.4.9 e incubar las células con 0,5 ml/pozo del pAb anti-Nluc diluido 1:1.000 en solución de dilución durante 1 h a 37 oC. Utilice el kit de fosfatasa alcalina ABC y el kit de sustrato de peroxidasa DAB siguiendo las recomendaciones del fabricante para la visualización de placas que expresan Nluc. Brevemente, lave las células de 4.4.10 tres veces con 1x PBS e incubarlas con 0,5 ml/pozo de anticuerpo secundario anticonejo biotinilado durante 1 h a 37 oC. Retire el anticuerpo secundario, lave las células tres veces con 1 x PBS e incubar con la solución ABC durante 1 h a 37 oC. Lave las células tres veces con 1x PBS y visualice las placas virales con el kit de sustrato DAB HRP. Escanee las placas inmunomanchadas utilizando un escáner convencional.NOTA: Se podrían utilizar otros kits similares para la inmunomancha. Mancha las placas virales con solución violeta cristalina durante 1 h a temperatura ambiente. Deseche el cristal violeta, lave las placas tres veces con agua, deje que las placas se sequen y escanee las placas de nuevo. Para determinar los lanzadores virales, cuente las placas reveladas después de la tinción violeta cristalina. Escanee las placas con un escáner convencional. Calcular el títer de virus como unidades formadoras de placa (PFU) por ml (PFU/ml). Para evaluar la estabilidad de BIRFLU in vivo, calcule el porcentaje de virus que expresan a los periodistas contando el número de placas teñidas de cristal violeta (número de virus infecciosos, paso 4.4.12) y compártalo con el número de placas que expresan Venus y Nluc ( 4.4.7 y paso 4.4.11, respectivamente).