키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.
키나아제 억제제의 스크리닝은 약물의 특성을 더 잘 이해하고 임상적 의미를 갖는 잠재적으로 새로운 표적을 식별하는 데 매우 중요합니다. 몇몇 방법론은 그 같은 검열을 달성하기 위하여 보고되었습니다. 그러나, 각각은 그것의 자신의 한계가 있습니다 (예를 들면, 유일한 ATP 유사체의 검열, 정제된 키나아제 도메인을 사용하는 제한, 한 번에 몇몇 키나아제 이상 시험과 관련되었던 중요한 비용, 및 단백질 키나아제를 가진 검열에 있는 융통성 의 부족 새로운 돌연변이). 여기서, 이러한 제한사항 중 일부를 극복하고 키나아제 억제제의 편견 없는 스크리닝에 사용될 수 있는 새로운 프로토콜이 제시된다. 이 방법의 강점은 여러 단백질에 걸쳐 키나아제 억제제의 활성을 비교하는 능력입니다, 다른 키나아제 또는 동일한 키나아제의 다른 변이체 사이. 인간 기반의 체외 전사 및 번역 시스템(IVTT)에 의한 단백질 키나아제의 발현을 통해 생성된 자가 조립 단백질 마이크로어레이가 채용된다. 마이크로어레이에 표시된 단백질은 활성상태이며, 키나아제 억제제의 효과를 측정할 수 있습니다. 다음 절차에서는 마이크로어레이 생성 및 스크리닝에서 데이터 분석에 이르는 프로토콜 단계를 자세히 설명합니다.
단백질 키나아제는 그들의 표적의 인산화에 책임 있고 많은 세포 기능을 통제하는 복잡한 분자 통로를 조절할 수 있습니다 (즉, 세포 증식, 분화, 세포 죽음 및 생존). 키나아제 활성의 규제 완화는 400개 이상의 질병과 관련이 있으며, 키나아제 억제제가 암, 심혈관 및 신경 장애뿐만 아니라 염증성 질환을 포함한 여러 질병의 치료에 사용할 수 있는 주요 약물 중 하나로 손대습니다. 및 자가 면역 질환1,2,3.
정밀 의학의 출현으로 새로운 치료법, 특히 키나아제 억제제의 식별은 제약 및 임상적으로 큰 매력을 가지고 있습니다. 키나아제 억제제의 de novo 설계 및 기존 FDA 승인 약물에 대한 새로운 표적의 식별을 포함하여 가능한 새로운 쌍의 키나아제/키나아제 억제제의 식별을 위해 여러 가지 접근법을 사용할 수 있습니다. 후자는 특히 매력적이다, 병원에서 이러한 약물을 구현하는 데 필요한 시간과 돈이 크게 이전 임상 시험 데이터의 가용성으로 인해 감소되기 때문에. 키나아제 억제제의 용도 변경의 정식 예는 imatinib, 처음에 BCR-Abl의 억제를 통해 만성 골수성 백혈병 (CML)의 치료를 위해 설계, 이는 또한 성공적으로 c-키트 과발현의 치료에 사용될 수있다 위장 기질 종양 (GISTs)4,5,6,7.
키나아제 억제제의 스크리닝은 결합 성 세포 또는 효소 계 세포계 검정에서 수행될 수 있다. 1차 검사는 단백질-약물 상호 작용에 초점을 맞추고 결찰 부위 및 친화성과 같은 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 해석의 시점에서 키나아제의 활성은 알려지지 않았기 때문에, 단백질의 형태 변화로 인해 다수의 상호작용이 놓치거나 잘못 규명될 수 있다. 한편, 효소 계 세포계 세포는 단백질 키나아제가 활성화되고 효소 활성에 대한 억제제의 효과에 관한 귀중한 정보를 제공해야 하지만, 이러한 유형의 스크리닝은 일반적으로 더 많은 시간과 비용이 소요된다. 현재, 두 가지 유형의 암세는 여러 소스에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그(것)들은 몇몇 한계를 가진 키나아제 억제제의 검열을 위한 믿을 수 있는 선택권을 나타냅니다: I) 방법의 대부분은 다중 키나아제의 시험을 개별적으로 관련시킵니다, 이는 많은 단백질 세트의 검열을 비용이 많이 들게 할 수 있습니다; II) 시험되는 키나아제 세트는 미리 선택된 야생형 키나아제 및 몇몇 잘 알려진 일부 키나아제의 목록으로 제한되어 많은 새로운 돌연변이 이소폼의 시험을 방해한다.
이러한 맥락에서, 단백질 마이크로어레이는 시판되는 기술에 의해 제시된 몇 가지 한계를 극복할 수 있는 강력한 플랫폼이다. 관심 있는 임의의 서열의 전신, 활성 단백질을 사용하여 고처리량 스크리닝에서 효소 기반 검술을 수행하는 데 적합합니다. 마이크로어레이는 단백질이 세포에 적시에 발현되는 NAPPA (핵산 프로그래밍 가능한 단백질 배열)와 같은 자가 조립 된 접근법에 의해 생성 될 수 있으며, 어레이에 표시된 단백질이 실제로 활성화 될 가능성을 증가시다. NAPPA에 표시 하는 단백질 자연 접기 및 활동의 가능성을 개선 하기 위해 인간 파생 된 리보솜과 샤페론 단백질을 사용 하 여 생산.
단백질은 처음에 포착 제와 함께, 마이크로 어레이 표면에, 포획 태그와 융합관심의 유전자를 위해 코딩 하는 cDNAs를 인쇄하여 프로그램됩니다. 단백질은 체외 전사 및 번역(IVTT) 시스템을 사용하여 마이크로어레이상에서 생산되고, 갓 발현된 단백질은 포획제에 의해 마이크로어레이 표면에 고정된다. 발현 된 NAPPA 어레이는 어레이에 표시되는 단백질의 연구에 사용할 수 있습니다, 높은 처리량 방식8,9.
이전에는 NAPPA 어레이에 표시된 단백질이 알려진 파트너10과상호 작용하기 위해 제대로 접혀 있음을 보여주었습니다. 더욱이, 이들의 효소 활성은 2018년에 처음 악용되었고, 그 때 는 마이크로어레이 자기포스포릴레이트11에표시되는 단백질 키나아제들이 나타났다. 현재까지, NAPPA 방법론은 바이오 마커 발견12,13,14, 15,16,17, 등 많은 뚜렷한 응용 프로그램에 사용되어 왔다. 단백질-단백질 상호작용10,18,기질 식별19,약물 스크리닝11. 유연성은 각 응용 프로그램에 적응할 수 있는 플랫폼의 주요 특성 중 하나입니다.
여기서, 자가 조립된 NAPPA 어레이에서 티로신 키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 프로토콜이 제시된다. 이 플랫폼은 활성 인간 단백질 키나아제의 표시와 낮은 배경 및 높은 동적 범위의 단백질 키나아제 활성 분석에 최적화되어 있습니다. 키나아제 억제제의 스크리닝을 위해 NAPPA를 사용하도록 구현된 변형 중에는: I) 인쇄 화학의 변화, II) 키나아제 억제제 스크리닝 전에 단백질 마이크로어레이의 탈인광, 및 III) 검출의 최적화가 포함된다. 어레이에 인산화 단백질. 이 프로토콜은 동종 최초이며 NAPPA 마이크로어레이의 키나아제 연구에 대한 고유한 정보를 제공합니다.
수정 및 문제 해결
NAPPA 어레이에 대한 키나아제 활성 연구의 최적화 단계 동안, 관찰된 배경 및 낮은 동적 범위의 주요 소스 중 하나는 인쇄 믹스에 사용된 BSA였다. BSA는 아미노실란 표면과 가교하는 데 필요한 1차 아민을 제공하고 DNA 및 포획 항체를 그 자리에서 트래핑했다. 그러나 BSA는 고광화되어 배경 잡음 위의 어레이에서 자가 포스포릴화 신호의 검출이 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 인쇄 믹스에서 BSA에 대한 몇 가지 대안을 테스트하고, 폴리 리신은 좋은 대용으로 확인되었다. 폴리-리신은 인산화 부위가 부족합니다. 따라서 표현되지 않는 배열의 배경은 매우 최소화됩니다. 또한 폴리 리신으로 인쇄 된 마이크로 어레이는 재현 가능하고 양호한 수준의 단백질을 표시합니다(그림 2).
표준 NAPPA 분석법에서 수행된 다음 중요한 변형은 인산염/DNase 처리 단계의 첨가였다. 인산파타제와 마이크로어레이의 치료는 단백질 합성 및 포획 동안 IVTT 혼합물에서 발생한 임의의 인산화를 제거할 수있다(도 3). 이러한 인산화의 근원은 본질적인 자가포스포릴화 활성 또는 IVTT 혼합물에 존재하는 키나아제의 활성으로부터 일 수 있다. 모든 인산화 후 발현의 제거는 활성 및 자가포스포릴화를 겪을 수 있는 키나아제의 용이한 식별을 허용하였다(도3).
프로토콜 내의 중요한 단계
NAPPA는 강력한 기술이지만 예상대로 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 적절한 농도에서 고품질 DNA를 획득하는 것입니다. 품질이 좋지 않거나 농도가 낮은 DNA를 사용하면 적절한 수준으로 표현및 표시되지 않는 여러 가지 특징을 가진 품질이 좋지 않은 마이크로어레이가 생성되어 어레이에서 분석된 단백질의 수가 줄어듭니다. 두 번째 중요한 단계는 마이크로어레이에 단백질의 발현이다. 높은 수준의 기능성 단백질을 발현하는 IVTT 시스템의 사용은 어레이에서 키나아제 활성을 연구하는 데 필수적입니다.
TKI 스크리닝의 다음 중요한 단계는 마이크로어레이를 처리하는 방법입니다. 마이크로어레이는 프로토콜의 모든 단계에서 건조되지 않아야 하며, 배경 신호를 증가시킬 수 있는 스크래치를 방지하기 위해 부드러운 취급을 권장합니다. 전체 실험의 배열을 서로 비교하므로 모든 인큐베이션 단계가 모든 슬라이드에 걸쳐 균일하게 되도록 하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 배열 간 인큐베이션 길이의 차이를 방지하기 위해 20개의 배열 일괄 처리가 처리될 때 단일 배열에서 한 단계를 수행하는 데 필요한 시간을 고려해야 합니다.
마지막으로, 실험 설계와 양수 및 음성 제어의 포함은 품질 관리 및 데이터 분석에 매우 중요합니다. 컨트롤의 첫 번째 세트는 각 배열에 인쇄된 컨트롤(즉, 빈 반점(인쇄된 재료 없이), 물 또는 빈 벡터(태그만 표현)]뿐만 아니라 포지티브 컨트롤(즉, 정제된 IgG)을 포함합니다. 이차 항체는 인산화 수준에서 변경에 불활성이다). 전체적으로, 마이크로어레이의 배경 수준, 인쇄 중 가능한 이월 및 검출 방법의 신호 강도를 측정합니다.
제어의 다음 세트는 약물 스크리닝 제어 및 탈인성 및 자가 포설마이크로어레이레이(DMSO의 존재 또는 부재)를 포함한다. 앞서 언급했듯이, 탈인성 마이크로어레이는 인산염 처리 후 인산화 수준을 측정하고 따라서 다른 모든 실험에 대한 기준선 수준을 측정한다. 기준선 수준이 낮을수록, 아시스의 동적 범위가 높아집니다. 자동 인포릴화 어레이는 모든 어레이의 최대 인산화 수준을 나타내며 신호는 강력하고 명확해야 합니다. 데이터 분석에 사용되지만 모든 반응이 어레이에서 성공적으로 수행되었다는 제어로도 사용됩니다.
기술의 한계
현재, 여기에 제시된 약물 스크리닝의 한계 중 하나는 자가 포설될 수 있는 단백질 키나아제만을 스크리닝하는 능력이다. 이를 극복하는 한 가지 가능한 방법은 동일한 자리에서 키나아제 및 공지된 기판을 인쇄하는 것이다. 2개의 명백한 단백질을 위한 DNA의 공동 인쇄는 성공적으로 이 접근의 타당성을 건의하는15를달성했습니다. 더욱이, 어레이에 표시되는 단백질은 비활성 단백질의 결과로 정확하게 접히지 않을 수 있습니다. 인간 기반 발현 시스템의 사용은 어레이상에서 측정된 키나아제 활성에서 현저한 개선을 이루었다; 그러나, 몇몇 단백질은 아직도 그것의 비활동 때문에 배열에 분석될 수 없습니다.
제2의 제한은 팬 항인광-타이터 항체를 이용한 인산화의 측정이다. 인산화 부위의 모티프에 관한 비 특이성에도 불구하고, 모든 측정 된 인산화는 티로신 잔류물에서 발생했으며 세린과 트레오닌 및 각각의 키나아제를 남겼습니다. 현재까지 10개 이상의 팬 포스포-Ser/Thr 항체는 인큐베이션 및 세척 조건을 최적화하기 위한 여러 시도에도 불구하고 성공하지 못하고 테스트되었습니다. 항체와 무관한 새로운 검출 시스템은 약물 억제를 위해 스크리처될 수 있는 단백질 키나아제의 수를 확장하는 최선의 선택이 될 수 있다. 이러한 맥락에서, 클릭 컨쥬게이션과 같은 방사능 또는 화학적 접근법을 포함하여 몇 가지 옵션을 사용할 수 있습니다. 배경 신호를 최소화하고 검역에 적합한 동적 범위를 제공하기 위해서는 일련의 최적화가 필요합니다.
세 번째 제한사항은 어레이에 인쇄할 cDNA 클론을 획득하는 것입니다. cDNA 클론은 크리에이터 또는 게이트웨이23과같은 사이트별 재조합 시스템을 포함하는 임의의 복제 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 또 다른 옵션은 DNAsu 라이브러리에서 클론을 구입하는 것입니다,에서 발견 , 여기서 이상 17,000 cDNA 클론, 전체 인간의 키노메를 포함, NAPPA 배열의 건설에 사용할 수24 .
네 번째 제한사항은 모든 실험실에 자체 NAPPA 어레이를 제작하고 선별할 수 있는 적절한 장비가 장착되어 있는 것은 아닙니다. 이 프로토콜은 처리량이 높은 장비없이 마이크로어레이에 인쇄되는 DNA를 생성하는 대체 방법과 모든 혼성화 단계를 수동으로 수행하는 프로토콜을 제공합니다. 그러나 어레이 및 마이크로어레이 스캐너에 대한 액세스는 여전히 필요합니다. 이 문제를 극복 하는 한 가지 옵션은 NAPPA 핵심 서비스 및 시설을 사용 하는 것입니다., 에서 발견 , 비영리 학술 가격에 사용자 정의 NAPPA 마이크로 어레이를 배포 하는. 마지막으로, 어떤 선별 방법론으로, 배열에 장악된 데이터는 유물 (양성 또는 부정)에 영향을 받기 쉬므로 직교 분석법을 사용하여 검증되어야합니다.
기존 방법에 대한 중요성
몇몇 플랫폼은 단백질 키나아제의 스크리닝을 위해 상업적으로 이용가능합니다. 일상적으로 사용되는 한 가지 접근법은 단백질 단편, 키나아제 도메인, 키나아제 도메인 및 일부 조절 영역을 가진 더 큰 단백질 단편, 심지어 전체 길이 단백질로 수행 될 수있는 결합 검사입니다. 단백질은 일반적으로 발현 및 정제 프로토콜의 비용 및 단순성 으로 인해 세균 시스템에서 발현된다. 관심 있는 약물과 단백질 사이의 상호작용은 예를 들어 형광 또는 태그의 존재와 같은 일부 유형의 보고서 분석으로 측정됩니다. 이 접근법 세트의 주요 제한은 단백질이 약물과의 상호 작용 중에 반드시 활성화되지 않는다는 사실이며, 이는 거짓 양성 및 거짓 음성 상호 작용의 식별을 초래할 수 있습니다. 단백질 단편은 형태 및 활성 의 부족에 있는 변경에 특히 취약하고 얻어진 모든 데이터는 활성 단백질을 사용하여, 바람직하게는 그들의 전체 길이 양식에서 검증되어야 합니다. 일부 플랫폼의 또 다른 제한사항은 ATP 아날로그만 스크리닝하여 전체 사용을 제한하는 기능입니다.
효소 기반 접근법을 사용하여 TKIs의 스크리닝을 위한 상업적으로 이용 가능한 대부분의 서비스는 관심 있는 키나아제의 야생형 버전만을 이용하고, 때로는 선택된 소수의 돌연변이만을 이용한다. 약물 내성이 TKI로 치료된 환자에서 매우 흔하다는 것을 아는 것은, 가장 적합한 억제제의 선택을 위해 상이한 돌연변이체에서 약물 반응을 측정할 수 있는 것이 중요하다. NAPPA의 특성으로 인해 키나아제 돌연변이체의 스크리닝은 간단하고 쉽게 수행 될 수 있으며, 유일한 필요한 도구는 사이트 별 돌연변이 발생에 의해 수행 될 수있는 NAPPA cDNA 컬렉션에 키나아제 돌연변이체의 통합입니다.
향후 응용 프로그램
키나아제 억제제를 이용한 암 치료에서 가장 흔한 치료 경과 의 한 가지는 치료 과정 동안 약물 표적에서 돌연변이를 획득하는 것이다. 키나아제 억제제에 대한 그들의 반응에 관하여 이 돌연변이의 검열은 각 환자를 위한 개인화한 처리를 달성하기 위하여 TKIs의 2/3 세대의 선택을 위한 생명 중요성입니다. 여기에 제시된 약물 스크리닝 접근법은, 임의의 티로신 키나아제 억제제가 인간 게놈에 존재하는 티로신 키나아제 패널에 대해 시험될 수 있는 편견 없는 스크리닝 플랫폼을 제공한다. NAPPA 어레이에 표시된 단백질은 슬라이드에 인쇄된 cDNA로부터 시험관 내에서 표현되기 때문에, 임의의 돌연변이 변이체는 어레이에 표시될 cDNA 컬렉션에 쉽게 통합될 수 있다. NAPPA 기술의 높은 처리량 파워와 결합된 키나아제 돌연변이체가 어레이상에서 생성되고 발현될 수 있는 시설은 키나아제 돌연변이체와 약물에 대한 반응을 연구할 수 있는 독특한 환경을 제공하여 NAPPA에 적합합니다. 정밀 의학의 목표 중 하나인 맞춤형 약물 스크리닝.
The authors have nothing to disclose.
저자는 프로젝트 개발 과정에서 LaBaer의 연구실에 있는 모든 사람들에게 도움과 비판에 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH 교부금 U01CA117374, U01AI077883 및 버지니아 G. 파이퍼 재단에 의해 지원되었다.
Reagent/Material | |||
364 well plates (for arraying) | Genetix | x7020 | |
800 µL 96-well collection plate | Abgene | AB-0859 | |
96-pin device | Boekel | 140500 | |
Acetic Acid | Millipore-Sigma | 1.00066 | |
Acetone 99.9% | Millipore Sigma | 650501 | |
Aluminum seal for 96 well plates | VWR | 76004-236 | |
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) | Pierce | 80370 | |
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Millipore Sigma | F3165 | |
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) | Millipore Sigma | F7425 | |
ATP 10 mM | Cell Signaling | 9804S | |
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Millipore-Sigma | G9422 | |
bacteriological agar | VWR | 97064-336 | |
Blocking Buffer | ThermoFisher/Pierce | 37535 | |
Brij 35 | ThermoFisher/Pierce | BP345-500 | |
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) | ThermoFisher/Pierce | 21580 | |
BSA (bovine serum albumin) | Millipore Sigma | A2153 | |
Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 48393-106 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | |
DeepWell Block, case of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0661 | |
DEPC water | Ambion | 9906 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Millipore-Sigma | D8418 | |
DNA-intercalating dye | Invitrogen | P11495 | |
DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
DTT | Millipore-Sigma | 43816 | |
EDTA | Millipore-Sigma | EDS | |
Ethanol 200 proof | Millipore-Sigma | E7023 | |
Filter plates | Millipore-Sigma | WHA77002804 | |
Gas Permeable Seals, box of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0718 | |
Glass box | Wheaton | 900201 | |
Glass slides | VWR | 48300-047 | |
Glycerol | Millipore-Sigma | G5516 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Millipore-Sigma | H1758 | |
HEPES Buffer Solution | Millipore-Sigma | 83264 | |
Human-based IVTT system | Thermo Scientific | 88882 | |
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule | ThermoFisher/Pierce | 31202 | |
Isopropanol | Millipore-Sigma | I9516 | |
KCl (Potassium chloride) | Millipore-Sigma | P9333 | |
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) | Millipore-Sigma | P5655 | |
Kinase buffer | Cell Signaling | 9802 | |
KOAc (Potassium acetate) | Millipore-Sigma | P1190 | |
Lambda Protein Phosphatase | new england biolabs | P0753 | |
Lifterslips, 24 x 60 mm | ThermoFisher Scientific | 25X60I24789001LS | |
Metal 30-slide rack with no handles | Wheaton | 900234 | |
MgCL2 (Magnesium chloride) | Millipore-Sigma | M8266 | |
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) | Millipore-Sigma | S6508 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Millipore-Sigma | S3014 | |
NaOAc (Sodium acetate) | Millipore-Sigma | S2889 | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Millipore-Sigma | S8045 | |
NucleoBond Xtra Midi / Maxi | Macherey-Nagel | 740410.10 / 740414.10 | |
Nucleoprep Anion II | Macherey Nagel | 740503.1 | |
Phosphoric Acid | Millipore-Sigma | 79617 | |
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | Millipore-Sigma | A-005-C | |
Protein Phosphatase (Lambda) | New England Biolabs | P0753 | |
RNAse | Invitrogen | 12091021 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | L6026 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | 05030 | |
Sealing gasket | Grace Bio-Labs, Inc | 44904 | |
Silica packets | VWR | 100489-246 | |
Single well plate | ThermoFisher/Nalge Nunc | 242811 | |
Sodium acetate (3M, pH 5.5) | Millipore-Sigma | 71196 | |
TB media (Terrific Broth) | Millipore-Sigma | T0918 | |
Tris | IBI scientific | IB70144 | |
Triton X-100 | Millipore-Sigma | T8787 | |
Tryptone | Millipore-Sigma | T7293 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P9416 | |
Yeast Extract | Millipore-Sigma | Y1625 | |
Name | Company | Catalog number | Yorumlar |
Equipments | Maker/model | ||
Programmable chilling incubator | Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling | ||
Shaker for bacterial growth | ATR Multitron shaker | ||
Vacuum manifold with liquid waste trap | MultiScreenVacuum Manifold 96 well | ||
96 well autopippetor/liquid handler | Genmate or Biomek FX | ||
Liquid dispenser | Wellmate | ||
DNA microarrayer | Genetix QArray2 | ||
Automatic hybridization station | Tecan HS4800 Pro Hybridization Station | ||
Microarray scanner | Tecan PowerScanner | ||
Microarray data quantification | Tecan Array-ProAnalyzer 6.3 |