自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

1. 使用する共通のバッファとソリューション 調用結核媒体:素晴らしいスープ(24 g/L酵母エキス、20 g/Lトリプトン、4 mL/Lグリセロール、0.017 M KH2PO4;および0.072 M K2HPO4)。0.017 M KH2PO4および 0.072 M K2HPO4ソリューションは、10 倍のリン酸バッファー (0.17 M KH2PO4および 0.72 M K2HPO4)として購入できます。 LB培地を調製: ルリア・ベルタニ (5 g/L 酵母エキス; 10 g/L トリプトン; 10 g/L NaCl).pH を 5 M NaOH で 7.0 に調整します。 1x TBSを準備:トリスバッファド生理生理生理(TBS:50 mMトリス-Cl、pH = 7.5;150 mM NaCl)。 1x TBSTを準備:TBSは0.1%の100%を補充した。 2. DNA製剤 注: NAPPA アレイに使用される DNA は非常に純粋でなければなりません。したがって、市販のDNAミニプレップはお勧めしません。現在、DNA調製のための2つのプロトコルが使用されています:ハウスハイスループットミニプレップ(ここに記載)または市販のMidi-またはマキシ準備で。社内ミニプレッププロトコルの平均スループットは、1人あたり1,500サンプルです。 社内のハイスループットミニプレップのための細菌の成長 LB/寒天オムニプレートを準備します。LB寒天の30-40 mL(陽性クローンの選択のための抗生物質を補充したLB培地の細菌学的寒天1.5%)を各単一のウェルプレートに注ぎます。 LB/寒天プレート上のスポットグリセロールストック。LB培地中のグリセロールストックを希釈する(1:300、通常は600μLのLBで2μL)。希釈したストックのスポット3 μLをLB/寒天プレートに10分間振ります。37 °C、上下逆さま、一晩でインキュベートします。 培養を予防接種する。80%のエタノールと炎で殺菌した96ピン装置を用いて、抗生物質を補充したTB培地のウェル当たり1.5mLの深部ブロックで寒天プレートから培養物を接種する。 文化をインキュベートする。ガス透過性シールでブロックを覆い、シェーカーに応じて37°C、300-800 rpmで22〜24時間インキュベートします。注:800 rpmに設定されたシェーカーは、このインキュベーションに最適です。より遅い速度シェーカーを使用すると、より密度の高い培養物と低いDNA精製収率をもたらす可能性があります。 ペレット培養。3,800 x gおよび4 °Cで30分間のスピンブロックは上清を捨てます。 社内のハイスループットミニプレップ注:マルチチャンネルピペッターまたは自動ディスペンサーを使用して、社内のハイスループットミニプレップを実行できます。自動ディスペンサーを使用する場合は、使用前およびソリューション間でシステムをクリーニングしてください。ミニ準備中に使用されるすべてのソリューションを準備します。 溶液1を準備する:TE再懸濁液バッファ(50 mMトリス、pH = 8.0;10 mM EDTA、pH = 8.0;0.1 mg/mL RNAE)。4 °Cで保存します。 ソリューション 2 を準備する: NaOH/SDS 溶解バッファー (0.2 M NaOH; 1% SDS)より良い結果を出すには、新たに作られた溶液を使用する必要があります。 ソリューション 3: KOAC 中和バッファー (2.8 M KOAc) を準備します。溶液のpHを氷河酢酸で5.1に調整します。4 °Cで保存します。 溶液N2を調製する:平衡バッファ(100 mMトリス、900 mM KCl;15%EtOH;0.15%トリトンX-100)。溶液のpHをリン酸で6.3に調整します。 ソリューション N3 を準備する: bash バッファ (100 mM トリス; 1.15 M KCl; 15% EtOH)溶液のpHをリン酸で6.3に調整します。 溶液N5を調出す:溶出バッファー(100 mMトリス、1M KCl;15%EtOH)。溶液のpHをリン酸で8.5に調整します。注:アニオン交換中のDNA結合、洗浄、溶出の制御が成功することは、バッファーKCl濃度およびpH値に大きく依存します。慎重なバッファコンポーネントの測定とpH調整が不可欠です。記載された測定値からの偏差が小さいと、歩留まりが著しなくなる可能性があります。 ペレットを再サスペンドします。溶液1の200 μLを追加し、RTで5分間2,000rpmで振ります。必要に応じてブロックを渦にします。 ライゼバクテリア。溶液2の200 μLを追加し、アルミニウムシールでプレートをシールし、5倍反転します。この手順は、ソリューション 2 の追加の最初から慎重に時間を取ります。5分を超えなす。 ソリューションを中和します。溶液3の200 μLを追加し、アルミニウムシールでプレートをシールし、5倍反転します。シールは、リシス/中和バッファーが原因で緩んでいる可能性があるため、反転時には注意が必要です。溶液がシールに触れない部分的な反転は、サンプル間のクロス汚染を防ぐために推奨されます。 リサートをクリアします。3,800 x gと 4 °C でプレートを遠心分離し、30 分間使用します。 リサートペレット遠心分離工程中にアニオン交換樹脂スラリーを調記する。1Lボトルを使用して、300 mLマークに達するまでアニオン交換樹脂で満たし、900 mLまで溶液N2を追加します。注意:このステップは、シリカ吸入から保護するためにフードで行う必要があります。 アニオン交換樹脂プレートを用意します。フィルタープレートを深い井戸ブロックの上に積み重ねて、廃棄物回収容器として機能させます。同種になるまでアニオン交換スラリーを混ぜ、ガラスの谷に注ぎます。広い退屈なP1000の先端を使用して、スラリーの450 μLをフィルタープレートの各ウェルに移します。 遠心分離機積層プレート(樹脂板/深井戸板)を130×gとRTで5分間の遅い加速で積み重ね、流れを捨てます。 樹脂板/深井戸ブロックスタックに上清を移します。積み重ねられたプレートを30 x gで5分間回転させ、ゆっくりとしたランプアップ速度を持ちます。 コラムを洗う。溶液N3(洗浄バッファー)を各ウェルに400μLを加えます。洗浄バッファーを除去するために真空マニホールドに樹脂プレートを転送します。洗浄手順を3回繰り返します。最後の洗濯時に、すべての井戸が適切に空にされていることを確認してください。スタックプレートを150 x gで5分間回転し、残留バッファーを除去します。 溶出DNA樹脂プレートをきれいな800μLの回収プレートの上に置きます。各ウェルに300 μLの溶液N5を加えます。RTに10分間座ってから、ゆっくりとしたランプアップ速度で20 x gで5分間積み重ねられたプレートを回転させます。積み重ねられたプレートを 233 x gで 1 分間回転させます。 DNAを定量し、さらに使用するか、DNA沈殿にまっすぐに進むまで-20°Cでプレートを保存します。注:サンプルあたり30 μg以上のDNAが必要です。DNA収率が低い場合は、DNAミニ調プリープを繰り返すか、降水ステップ中に2枚のプレートを組み合わせることをお勧めします(セクション2.3)。 DNA沈殿 プレートを解凍し、DNA溶液を均質化する渦を、230 x gで30sで回転させ、ウェルの底部にすべての溶液を集める。 各ウェルに3 M NaOAcの40 μLと240 μLのイソプロパノールを加えます。アルミシールでプレートを覆い、3倍反転して混ぜます。 3,800 x gおよび25 °Cで30分間プレートを遠心分離する。上清を慎重に捨てます。注:2つのプレートを組み合わせるには、2番目のプレートから最初のプレートにDNAを移し、ステップ2.3.2-2.3.3を繰り返します。 DNAを洗浄して沈殿させる。各ウェルに80%エタノールの400 μLを追加します。アルミシール付きシールプレートを30分間1,000rpmで30分間振り、25°Cで30分間3,800 x g。上清を捨てます。 DNAペレットを乾燥させます。プレートをペーパータオルの角度で逆さまに置き、井戸の底にアルコールが存在しないまで1〜2時間乾燥させます。任意のペレットをダウンさせるために2分間230 x gでシールと遠心分離機。 プレートが乾燥したら、アルミシールでシールし、後で使用するために-20 °Cで凍結するか、DNAを再中断し続けます(ステップ4.1)。 3. アミノシランスライドコーティング ガラススライドを金属製のラックに置きます。各スライドを目視で検査し、傷や欠陥がないことを確認します。 ロッキング中に15分間、コーティング溶液(アセトン中2%アミノシラン試薬)にスライドを沈める。アミノシラン溶液は、廃棄する前に、それぞれ30枚のスライドの2つのラックをコーティングするために使用することができます。 すすりステップ。スライドラックをアセトン洗浄(99%アセトン)で水没させ、前後に振り、その後、すばやく5倍上下します。1つのコーナーに傾けて滴り落ち、ウルトラピュアウォーターを素早く上下5倍に沈めます。滴下に傾け、ナプキンの上に置く。注:アセトン洗浄は2回使用できますが、超純水は毎回交換する必要があります。 圧力空気を使用して乾燥スライドを、すべての水滴が除去されるまで約3分間、すべての角度からそれらを吹き飛ばします。コーティングされたスライドは、密閉された箱の中の金属製のラックにRTで保管してください。 4. アレイサンプルの準備 20μLの超純水で社内ミニプレップ(ステップ2.3.6)からDNAペレットを再ステーペンし、2時間1,000rpmで振ります。ミディ/最大準備DNAの場合は、各サンプルを1.5 μg/μLの最終濃度に希釈し、20 μLを800μLの回収プレートに移します。 印刷ミックスを準備します。1つの96ウェルプレートの場合は、印刷ミックスの1 mL[237.5 μLの超純水;500 μLのポリリジン(0.01%);BS3の187.5 μL(ビス・スルホスクシニミジル、DMSOで50mg/mL)、および75 μLのポリクローナル抗水フラグを調製します。注:化学物質は、沈殿を避けるために指定された順序で追加する必要があります。 各サンプルに10μLの印刷ミックスを追加し、アルミ箔でプレートをシールし、1,000rpmで90分間RTで振ります。プレートを一晩(約16時間)4°Cに保管します。 印刷日に、簡単に渦とプレートを回転させます。各サンプルの28 μLを384アレイプレートに移します。この転送は、オートメーションまたはマルチチャンネルピペットを使用して行うことができます。384アレイプレート内のサンプルの位置を追跡することが重要です。 プレートを短時間回転して泡を取り除きます。プレートをホイルで密封します。 5. NAPPAアレイの生成:マイクロアレイ印刷 注:すべての印刷条件は、機器と材料の表に記載されている機器に最適化されました。別の配列を使用する場合は、さらに最適化が必要な場合があります。 アレイラークリーンアップ。開始する前に、すべての廃棄物タンクを空にし、必要に応じて、超純水または80%エタノールで貯水池を補充します。糸くずのないワイプと超純水でピンを一つずつきれいにします。糸くずのフリーワイプでピンを乾かし、慎重にアレイザーヘッドに戻します。 Arrayer のセットアップ: 印刷仕様 [インクあたりのスタンプの最大数: 1; 1; マルチスタンプタイミング: –; スタンプ時間 (ms): 0 ミリ秒; インク時間 (ms): 0 ms; 印刷深度調整: 90 ミクロン; タッチオフ数: 0].殺菌プロトコル:乾燥時間の0ミリ秒と待ち時間の500ミリ秒で2,000ミリ秒の超純水洗浄。これらの手順を 6x 繰り返します。その後、80%のエタノールを2,000ミリ秒、乾燥時間1,200ミリ秒、待ち時間500msで洗浄します。これらの手順を 6 倍繰り返します。 スライド設計: 必要な配列パターンでアレイアを設定します。設計では、サンプルごとのレプリカ数、コントロールフィーチャの位置と数、配列レイアウト (1 ブロック、複数の同一ブロック)、印刷する配列の数、実行の長さなど、いくつかの要因を考慮する必要があります。 アレイラーデッキにアミノシランコーティングされたスライド(ステップ3.4)を配置します。すべてのスライドがしっかりと保持されているかどうかを確認します。加湿器を起動します(60%に設定する必要があります)。 384ウェルプレートをアレイザーデッキに置きます。プログラムを起動します。 マイクロアレイにラベルを付けます。印刷が完了したら、各スライドの下部(印刷されていない)側にスライドラベルを配置します。デッキ上のスライド印刷順序を数値順に維持します。 印刷されたアレイをRTの金属ラックに保管し、シリカパケットを入れた密閉された箱の中に保管してください。乾燥した環境で保たれるスライドは1年までの貯蔵寿命を有する。 (オプション): 90 枚のスライドの 2 番目のバッチは、同じサンプルを使用して印刷できます。そうするには、プレートの印刷が完了したらすぐにアレイヤデッキから384ウェルプレートを取り外します。プレートを4°Cでシールして保管してください。配列の最初のバッチが完全に完了したら、デッキからそれらを削除し、新しいアミノシランコーティングされたスライドを配置し、新しい実行を開始します。各384ウェルプレートは、使用前に30分間RTであることを確認してください。サンプル1個につき4個以上のレプリカがスライドのバッチで印刷される場合は、384ウェルプレートを2つのプレートに分割して、アレイヤデッキに費やす時間を減らすことでサンプル蒸発を減少させることをお勧めします。注: 2 回目の実行の開始前にすべてのリザーバを確認してください。 6. NAPPAスライド上のDNAの検出 スライドをブロックします。スライドをピペットボックスに入れ、30 mLのブロッキングバッファを追加します。ロッキングシェーカーで1時間RTでインキュベートします。 スライドを汚します。ブロッキング溶液を廃棄し、20 mLのブロッキングバッファーと33μLの蛍光DNAインターカリング色素を添加する。攪拌で15分間インキュベートします。その後、素早く超純水でスライドをすすいで、圧力空気で乾燥させます。スキャンを続行します (セクション 11)。 7. NAPPA スライドの表現 RTでロッキングシェーカーのブロッキングバッファでスライドをブロックし、4つのスライド用のピペットボックスに約30 mLを使用します。 超純水でスライドをすすり、濾過された圧縮空気で乾燥させます。製造元の指示に従って各スライドにシールガスケットを適用します。 IVTTミックスを追加します。各スライドはIVTTミックスの150 μLを必要とする。HeLaの82.5 μLをDEPC水の33μLで希釈し、16.5 μLのアクセサリタンパク質と33 μLの反応ミックスを補充します。非標識または非試料端部からIVTTミックスを添加する。ミックスをゆっくりとピペットします(入り込み端で一時的にビーズアップした場合は許容されます)。IVTTミックスが広がり、アレイの全領域をカバーできるように、シールガスケットを静かにマッサージします。両方のポートに小さな丸いポート シールを適用します。 スライドをサポートに配置し、プログラム可能な冷却インキュベーターに転送します。タンパク質発現のために30°Cで90分間インキュベートし、続いて15°Cで30分間、照会タンパク質の固定化を行う。 スライドを洗ってブロックします。シールガスケットを取り出し、約30 mLの1x TBSTのピペットボックスにスライドを取り出し、タンパク質表示用の5%ミルク(セクション8)またはキナーゼアッセイまたは薬物スクリーニング用の3%ウシ血清アルブミン(BSA)を補充した1x TBSTを補充します(セクション9)。RTで20分間攪拌してインキュベートし、このステップ2倍を繰り返します。 8. NAPPAアレイ上のタンパク質の検出 一次抗体を添加する。ブロッキング溶液(ステップ7.5)からスライドを取り外し、ペーパータオルを使用して裏面(印刷されていない側)を静かに乾かします。スライドを支持体に置き、1x TBST + 5%ミルクで希釈した一次抗体(マウスアンチフラグ)の600 μLを適用します。RTで1時間インキュベートします。 ロッキングシェーカー(各5分間3x)に1x TBST + 5%ミルクでスライドを洗います。 二次抗体を添加する。洗濯液からスライドを取り出し、ペーパータオルで裏面をやさしく乾かします。スライドを支持体に置き、1x TBST + 5%ミルクで希釈した2次抗体(cy3-labbeled抗マウス抗体)の600 μLを塗布します。ライトからスライドを保護し、RTで1時間インキュベートします。 ロッキングシェーカー(各5分間3x)に1x TBSTでスライドを洗います。超純水でスライドを素早くすすいで、圧力空気を使って乾燥させます。スキャンを続行します (セクション 11)。 9. NAPPAアレイにおけるチロシンキナーゼ阻害剤スクリーニング 注: 同じテストでは複数のスライドを処理できますが、各ステップで 1 つのスライドが一度に処理され、ステップ間で乾燥していないことを確認してください。スライドの非ラベルまたは非標本の端にすべての溶液を追加します。 薬物スクリーニング中に使用されるすべてのソリューションを準備します。 以下を組み合わせてホスファターゼ/DNase溶液を調製する:1xタンパク質メタロホスファターゼバッファー(50 mM HEPES、100 mM NaCl、2 mM DTT、0.01% Brij 35 pH = 7.5);1 mM MnCl2;ラムダタンパク質ホスファターゼの8,000単位;DNase I. 2単位のDNase I. 各マイクロアレイに対して400 μLの溶液を準備します。使用直前にホスファターゼとDNaseを追加します。 薬物希釈を行う。薬物は、10 mMの最終濃度にDMSOで再構成される。アレイでテストされたすべての薬物濃度を保証するには、濃度ごとに同じ体積のDMSO(DMSOの10,000倍のストック)が作成され、-80°Cに保たれていることを確認してください。使用時に、薬物は水中で1:100希釈される。 以下を組み合わせて薬剤/キナーゼ溶液を調製する: 1xキナーゼバッファー (pH = 7.5の25 mMトリス-HCl);5 mM β-グリセロリン酸;2 mM DTT;0.1 mM Na3VO4;10 mM MgCl2;500 μM ATP;そして2 μLの薬物(水中で1:100を希釈した)。マイクロアレイごとに200μLの溶液を準備します。 ホスファターゼおよびDNase処理を行う。ブロッキング溶液(ステップ7.5)からスライドを取り外し、ペーパータオルで裏面を静かに乾かします。スライドをサポート上に置き、200 μLのホスファターゼ/DNase溶液を適用します。蒸発を避けるためにマイクロアレイカバースリップを配置します。オーブンで45分間30°Cでインキュベートします。 ホスファターゼおよびDNase処理II:オーブンからアレイを除去し、カバースリップを破棄し、余分な溶液を除去し、作りたてのホスファターゼおよびDNase溶液の200 μLを適用する。マイクロアレイをカバースリップで覆い、オーブンで30°Cでさらに45分間インキュベートします。 ロッキングシェーカーに1x TBST + 0.2 M NaClでスライドを洗います(各5分間3x)。 薬物治療およびキナーゼ反応を行う。洗濯液からスライドを取り出し、ペーパータオルで裏面をやさしく乾かします。スライドをサポート上に置き、200 μLの薬剤/キナーゼ溶液を適用します。蒸発を避けるために、カバースリップを上に置きます。オーブンで30°Cで1時間インキュベートします。 ロッキングシェーカーに1x TBST + 0.2 M NaClでスライドを洗います(各5分間3x)。 1:100を希釈した一次抗体抗体抗体として使用して8.1〜8.4を繰り返す。1x TBST + 5% ミルクを 1x TBST + 3% BSA ですべてのステップで置き換えます。 10. 自動ハイブリダイゼーションプロトコル 注: また、ハイブリダイゼーション ステーションを使用して、NAPPA アレイ (セクション 7 から 9) 上のすべてのハイブリダイゼーションと洗面所を自動化し、プロトコルを補足ファイル 1として提供します。 11. 画像取得 注:マイクロアレイ画像は、20ミクロン以上の解像度で取得する必要があります。 マイクロアレイをスライドホルダーマガジンにロードし、タンパク質を上向きにします。マガジンをマイクロアレイスキャナにロードします。 575/30 nm発光フィルタを使用して緑色のレーザーを選択し、cy-3標識付き二次抗体からの信号をスキャンします。別の蛍光色素を使用する場合は、蛍光色素からの信号を検出するために正しいレーザー/波長を選択します。 各イメージの名前と保存場所を定義します。 (オプション):新しい蛍煙管ごとに、信号強度の線形範囲を検出するためにスキャン条件の最適化が推奨されます。これを行うには、光増倍量(PMT)の範囲を使用してマイクロアレイをスキャンし、不飽和信号と低い背景で鮮明な画像が得られるまでゲインします。 最適化された設定ですべてのマイクロアレイをスキャンし、自動ゲインをオフにすることを忘れないでください。注: データ分析の場合、すべてのマイクロアレイを同じスキャン設定でスキャンする必要があります。cy3を蛍光色素として使用するキナーゼアッセイでは、装置および材料の表に記載されているスキャナを使用して、画像を20%PMT、25%のレーザー強度、および10ミクロンの分解能でスキャンします。 12. データ処理・分析 注: 同様の機能を持つマイクロアレイデータの定量化には、いくつかのソフトウェアパッケージを用意しています。ここで説明する手順は、機器および材料の表に記載されているソフトウェア用に設計されています。 定量化するTIFFファイルをロードし、マイクロアレイレイアウトに合わせてグリッドを設計し、可能な限り最小領域で信号全体を組み込むためにスポットのサイズを調整します。隣接するスポットは重なり合ってはなりません。ソフトウェアのパフォーマンスを視覚的に検査し、必要に応じてグリッドを手動で調整します。 マイクロアレイの信号強度を定量します。スポットに異常(非特異的結合、ほこりなど)がないか目視で検査し、データ分析から取り除きます。 スポットが存在しないアレイ上の隣接エリアの信号を使用して、バックグラウンドをローカルで修正します。 データを正規化します。異なるアレイ間で信号を比較するには、各マイクロアレイの信号強度を正規化する必要があります。外れ値を除外するには、脱リン酸化マイクロアレイの正対照(IgGスポット)からの信号の30%をトリミングしてデータを正規化します。注:IgGスポットからの信号は、マイクロアレイのリン酸化および脱リン酸化中に変化せず、正規化に適しています。 アクティブなキナーゼを識別します。マイクロアレイに表示される各フィーチャーについて、自動リン酸化アレイと脱リン酸化アレイにおける正規化された信号強度の比率を計算します。活性キナーゼの同定に対して1.5倍の変更のしきい値を設定し、他のすべての機能を自動リン酸化(N/A)を受けることができないとしてマークします。 ステップ12.5で識別された各キナーゼの活性を、調整された信号のパーセンテージ(正規化された正対照アレイ(DMSO)の信号強度)を正規化された負の制御アレイ(脱リン酸化)によって差し引いたものとして計算する。