自组装的人类蛋白质微阵列中的激酶抑制剂筛选

1. 常用缓冲器和解决方案 制备TB培养基：特碎的汤（24克/升酵母提取物;20克/升胰蛋白石;4 mL/L甘油;0.017 M KH2PO4;和0.072 M K2HPO4）。0.017 M KH2PO4和 0.072 M K2HPO4解决方案可作为 10 倍磷酸盐缓冲液（0.17 M KH2PO4和 0.72 M K2HPO4） 购买。 制备LB介质：卢里亚-贝尔塔尼（5克酵母提取物;10克/升锥酮;和10克/升纳Cl）。使用 5 M NaOH 将 pH 调整到 7.0。 准备 1x TBS： 三层缓冲盐水 （TBS： 50 mM Tris-Cl， pH = 7.5; 150 mM NaCl）。 准备 1x TBST： TBS 辅以 0.1% 补间 20. 2. DNA制备 注：用于NAPPA阵列的DNA必须高度纯净;因此，不推荐使用商业DNA小预准备。目前，使用两种DNA制备协议：内部高通量微型制备（此处描述）或商业Midi-或Maxi-prep。内部小型准备协议的平均吞吐量为每人每天 1，500 个样本。 内部高通量小型制备的细菌生长 准备LB/Agar全板。将 30–40 mL 的 LB 琼脂（LB 培养基中 1.5% 的细菌琼脂辅以抗生素选择阳性克隆）倒入每个孔板中。 现货甘油库存在LB/琼脂板上。在 LB 介质中稀释甘油库存（1：300，通常在 600 μL 的 LB 中为 2 μL）。摇动10分钟。 将稀释的库存的Spot 3 μL摇到LB/agar板上。在 37°C 下孵育，倒置，过夜。 接种文化。使用在80%乙醇和火焰中灭菌的96针装置，在深井块中接种琼脂板的培养物，每孔1.5 mL，并辅以抗生素。 孵化文化。用透气密封覆盖块，在 37°C、300–800 rpm 下孵育 22-24 小时，具体取决于摇床。注：设置为 800 rpm 的摇床是这种孵育的最佳选择。使用速度较慢的摇床可能会导致培养物密度降低，DNA纯化产量降低。 球菌文化。在3，800 x g和4°C下旋转方块30分钟。丢弃上清液。 内部高通量小型准备注：多通道移液器或自动分配器可用于执行内部高通量小型准备。如果使用自动分配器，请确保在使用前和解决方案之间清洁系统。准备小型准备期间使用的所有解决方案： 制备溶液1：TE重悬浮缓冲液（50 mM Tris，pH = 8.0;10 mM EDTA，pH = 8.0;0.1毫克/mLRNA酶）。储存在4°C。 准备解决方案 2：NaOH/SDS 解液缓冲器（0.2 M NaOH;1% SDS）。为了获得更好的结果，应使用新制作的解决方案。 准备解决方案 3：KOAC 中和缓冲器 （2.8 M KOAc）。使用冰川醋酸将溶液的pH量调整到5.1。储存在4°C。 制备溶液N2：平衡缓冲液（100 mM Tris;900 mM KCl;15%EtOH;0.15%Triton X-100）。用磷酸将溶液的pH量调节到6.3。 制备溶液N3：巴什缓冲液（100 mM Tris;1.15 M KCl;15%EtOH）。用磷酸将溶液的pH量调节到6.3。 制备溶液N5：洗脱缓冲液（100 mM Tris;1 M KCl;15%EtOH）。用磷酸将溶液的pH量调节到8.5。注：在阴极交换期间成功控制DNA结合、洗涤和洗脱高度依赖于缓冲KCl浓度和pH值。仔细的缓冲元件测量和 pH 调整至关重要。与所述测量值的微小偏差可能会导致产量的显著损失。 重新悬浮颗粒。加入200 μL溶液1，在2000rpm下在RT下摇动5分钟。如有必要，涡旋块。 莱塞细菌。加入200 μL溶液2，用铝密封密封板并倒置5倍。仔细时间此步骤从解决方案 2 的开头添加。不要超过 5 分钟。 中和解决方案。加入200 μL溶液3，用铝密封密封板并倒置5倍。由于分解/中和缓冲液，密封件可能会松动，因此在反转时应小心谨慎。建议采用局部反转（其中溶液从不接触密封件）以防止样品之间的交叉污染。 清除莱沙。在 3，800 x g和 4 °C 下离心板 30 分钟。 在赖糖颗粒离心步骤期间制备联尼气交换树脂浆料。使用 1 L 瓶，将其填充到 iion 交换树脂中，直到达到 300 mL 标记，然后添加高达 900 mL 的溶液 N2。注意：此步骤应在发动机罩中执行，以防止吸入二氧化硅。 准备网换树脂板。将过滤板堆叠在深井块的顶部，作为废物收集容器。混合网倾浆，直到它均匀，然后倒入玻璃槽。使用宽孔 P1000 吸头，将 450 μL 的浆料转移到过滤板的每个孔中。 离心机堆叠板（树脂板/深井板）在 130 x g和 RT 下缓慢加速 5 分钟。丢弃流过。 将液前液转移到树脂板/深井块堆栈。以缓慢加速的速度在 30 x g下旋转堆叠板 5 分钟。 洗涤柱。在每个井中加入400 μL溶液N3（洗涤缓冲液）。将树脂板转移到真空歧管以去除洗涤缓冲液。重复洗涤步骤 3 倍。在最后一次清洗时，确保所有水井都正确清空。以 150 x g旋转堆叠板 5 分钟，以清除任何残余缓冲液。 埃鲁特DNA将树脂板放在干净的 800 μL 收集板上。在每个井中加入300 μL溶液N5。让它在 RT 处坐 10 分钟，然后在 20 x g下以缓慢的加速速度旋转堆叠板 5 分钟。在 233 x g下旋转堆叠板 1 分钟。 在-20°C下定量DNA和储存板，直到进一步使用或直接进入DNA沉淀。注：每个样品至少需要30μg的DNA。如果DNA产量低，建议重复DNA小准备，或在沉淀步骤期间组合两个板（第2.3节）。 DNA沉淀 解冻板，涡旋使DNA溶液均质化，以230 x g旋转30s，收集井底的所有溶液。 在每个井中加入40μL的3M NaOAc和240μL异丙醇。用铝制密封件盖住板，然后倒置 3 倍进行混合。 在 3，800 x g和 25 °C 下将板离心 30 分钟。小心地丢弃上清液。注：要组合两个板，请将DNA从第二板转移到第一个板的颗粒中，并重复步骤2.3.2~2.3.3。 清洗和沉淀DNA。在每个井中加入400 μL的80%乙醇。带铝密封的密封板，在 1，000 rpm 下摇动 30 分钟，在 3，800 x g下离心 30 分钟，在 25°C 下摇动 30 分钟。丢弃上清液。 干燥DNA颗粒。将盘子倒置放在纸巾上，让它们干燥 1⁄2 小时，直到井底没有酒精。以 230 x g密封和离心机 2 分钟，使任何颗粒下降。 一旦板干燥，用铝密封密封，并在-20°C冷冻，以供以后使用或继续重新悬浮DNA（步骤4.1）。 3. 阿米尼西兰滑动涂层 将玻璃玻片放在金属架上。目视检查每张幻灯片，确保不存在划痕或瑕疵。 在涂层溶液中浸没滑动（丙酮中的2%氨基硅烷试剂）在摇动时浸泡15分钟。氨基硅烷溶液可用于在需要丢弃之前覆盖两个机架，每个机架有 30 张幻灯片。 冲洗步骤。将滑架浸入丙酮洗涤（99%丙酮），来回摇动，然后快速上下 5 倍。倾斜到一个角落滴落，然后淹没在超纯水上下快速5倍。倾斜以滴落，然后放在餐巾上。注：丙酮洗涤可使用两次，而超纯水每次必须更换。 使用压力空气干燥滑轨，从各个角度吹上它们约 3 分钟，直到所有水滴都已清除。将涂层滑轨存放在金属机架中的金属机架中，内装有密封的盒子。 4. 阵列样品制备 将内部迷你准备（步骤 2.3.6）中的 DNA 颗粒重新悬浮在 20 μL 的超纯水中，并在 1，000 rpm 下摇动 2 小时。对于 midi/max 制备 DNA，将每个样品稀释至 1.5 μg/μL 的最终浓度，并将 20 μL 转移到 800 μL 收集板。 准备打印组合。对于一个96孔板，准备1mL的印刷混合物[237.5μL的超纯水;500μL的多赖氨酸（0.01%）;187.5μL的BS3（二氧化硫，50毫克/mL在DMSO）;和75μL的多克隆抗旗兔抗体]。注：应按指定顺序添加化学品，以避免降水。 在每个样品中加入 10 μL 的打印混合物，用铝箔密封板，并在 1，000 rpm 转速下在 RT 下摇动 90 分钟。将盘子在4°C下过夜（±16小时）。 在打印当天，短暂地旋转和旋转印子。将每个样品的 28 μL 转移到 384 阵列板。这种传输可以使用自动化或多通道移液器完成。跟踪 384 阵列板中样品的位置至关重要。 将板向下旋转，以去除任何气泡。用铝箔密封板。 5. 国家适应行动方案阵列的生成：微阵列打印 注：所有打印条件均针对设备和材料表中列出的仪器进行了优化。如果使用其他数组，则可能需要进一步优化。 阵列清理。启动前，根据需要，清空所有废物罐，并加注超纯水或 80% 乙醇。用无绒湿巾和超纯水逐一清洁针脚。用无绒湿巾擦干针脚，并小心地将它们放回阵列头。 阵列设置：印刷规格[每印油墨最多邮票数量：1;每点邮票数量：1;多枚邮票时间：–;印迹时间（毫秒）：0毫秒;墨迹书写时间（毫秒）：0毫秒;打印深度调整：90微米;接触次数：0。然后，按照灭菌方案：超纯水洗2000ms，干燥时间为0ms，等待时间500ms;重复这些步骤 6 倍;其次是用80%乙醇清洗2000ms，干燥时间1200ms，等待时间500毫秒;重复这些步骤 6 倍。 幻灯片设计：使用所需的阵列模式设置阵列器。设计应考虑几个因素[即每个示例的副本数、控制功能的位置和数量、数组布局（一个块、几个相同的块）、要打印的数组数、运行长度等]。 将氨基硅烷涂层滑轨（步骤 3.4）放在阵列甲板上。检查真空是否牢固地将所有滑轨固定到位。启动加湿器（应设置为 60%）。 将 384 孔板放在阵列甲板上。启动程序。 为微阵列添加标签。打印完成后，将幻灯片标签放在每张幻灯片的底部（非打印）侧。按数字顺序维护幻灯片打印顺序。 将打印的阵列存储在 RT 的金属机架中，内装有二氧化硅包的密封盒内。在干燥环境中保存的幻灯片的保质期可达一年。 （可选）：第二批 90 张幻灯片可以使用相同的示例打印。为此，在打印完板后，立即从阵列甲板上拆下 384 孔板。密封板并将其存放在 4°C。第一批阵列完全完成后，将它们从甲板上移除，放置新的氨基硅烷涂层幻灯片，并开始新的运行。确保每个 384 孔板在使用前 30 分钟在 RT 处。如果每个样品的四个副本打印在一批幻灯片中，建议将 384 孔板分成两个板，通过减少阵列甲板上的时间来减少样品蒸发。注：在第二次运行开始之前检查所有储层。 6. 在NAPPA幻灯片上检测DNA 阻止幻灯片。将幻灯片放入移液器盒中，并添加 30 mL 的阻塞缓冲液。在 RT 上在摇摇器上孵育 1 小时。 弄脏幻灯片。放弃阻滞溶液，加入20 mL的阻断缓冲液和33μL的荧光DNA间染。用搅拌孵育15分钟。然后，用超纯水快速冲洗幻灯片，然后用高压空气干燥。继续扫描（第 11 节）。 7. 国家适应行动方案幻灯片的表达 在 RT 的摇摇器上用阻塞缓冲器将幻灯片阻塞 1 小时。 在移液器盒中使用大约 30 mL 进行四张幻灯片。 用超纯水冲洗幻灯片，用过滤过的压缩空气擦干。根据制造商的说明，将密封垫片应用于每张幻灯片。 添加 IVTT 混合。每张幻灯片需要 150 μL 的 IVTT 混合。在33μL的DEPC水中稀释82.5μL的HeLa解酶，并补充16.5μL的附件蛋白和33 uL的反应混合物。从非标签或非试样端添加IVTT混合物。缓慢地将混合物移入中（如果珠子暂时在入口端向上，则是可以接受的）。轻轻按摩密封垫片，使 IVTT 混合分散并覆盖阵列的整个区域。将小圆端口密封件应用于两个端口。 将幻灯片放在支架上，并将其转移到可编程的冷却培养箱中。在30°C下孵育90分钟，用于蛋白质表达，随后在15°C孵育30分钟，用于查询蛋白的固定。 清洗并阻止幻灯片。取出密封垫片，将滑梯浸入移液器盒中，其内约 30 mL 的 1x TBST 辅以 5% 牛奶用于蛋白质显示（第 8 节）或 1x TBST，并辅以 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 用于激酶测定或药物筛查（第 9 节）。在RT孵育20分钟，重复此步骤2倍。 8. 检测国家适应行动方案阵列上的蛋白质 添加原抗体。从挡块溶液（步骤 7.5）中取出滑轨，并使用纸巾轻轻擦干背面（非打印侧）。将幻灯片放在支架上，在 1x TBST = 5% 牛奶中涂抹 600 μL 原抗体（小鼠抗旗）稀释 1：200。在 RT 孵育 1 小时。 在摇摇器上用 1x TBST + 5% 牛奶清洗幻灯片（每个 3 次 5 分钟）。 添加二级抗体。从洗涤溶液中取出滑片，并使用纸巾轻轻擦干背面。将幻灯片放在支架上，在 1x TBST = 5% 牛奶中涂抹 600 μL 的二次抗体（cy3-labbeled 抗小鼠抗体）稀释 1：200。保护幻灯片免受光线照射，并在 RT 孵育 1 小时。 在摇摇器上用 1x TBST 清洗幻灯片（每个 3 次，每次 5 分钟）。用超纯水快速冲洗幻灯片，并使用高压空气干燥。继续扫描（第 11 节）。 9. 在NAPPA阵列上进行酪氨酸激酶抑制剂筛查 注： 可以在同一实验中处理多个幻灯片，但是，确保在每个步骤中，一次处理一张幻灯片，并且它们不会在步骤之间干燥。将所有解决方案添加到幻灯片的非标签或非试样端。 准备药物筛查期间使用的所有溶液： 通过组合以下方法制备磷酸酶/DNase溶液：1x蛋白质金属磷酸酶缓冲液（50 mM HEPES，100 mM NaCl，2 mM DTT，0.01% Brij 35，pH = 7.5）;1 mM MnCl2;8，000单位羊肉蛋白磷酸酶;和2个单位的DNase I.为每个微阵列准备400μL的溶液。在使用前添加磷酸酶和DNase。 使药物稀释。药物在DMSO中重组，最终浓度为10 mM。为了确保在阵列上测试的所有药物浓度，确保为每个浓度创建相同体积的 DMSO（DMSO 中的 10，000x 库存），并保持在 -80°C。在使用时，药物在水中被稀释1：100。 通过组合以下药物/激酶溶液：1x激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl的pH= 7.5）;5 mM β-糖酸酯;2 mM DTT;0.1 mM Na3VO4;10 mM MgCl2;500 μM ATP;2 μL的药物（在水中稀释1：100）。为每个微阵列准备 200 μL 溶液。 进行磷酸酶和DNase治疗。从挡块溶液（步骤 7.5）中取出滑轨，并使用纸巾轻轻擦干背面。将幻灯片放在支架上，并应用 200 μL 的磷酸酶/DNase 溶液。放置微阵列盖玻片，以避免蒸发。在30°C下在烤箱中孵育45分钟。 磷酸酶和DNase治疗II：从烤箱中取出阵列，丢弃盖玻片，去除多余的溶液，并应用200μL的新鲜磷酸酶和DNase溶液。用盖玻片覆盖微阵列，并在烤箱中30°C孵育45分钟。 在摇摇器上用 1x TBST + 0.2 M NaCl 清洗幻灯片（每个 3 次 5 分钟）。 进行药物治疗和激酶反应。从洗涤溶液中取出滑片，并用纸巾轻轻擦干背面。将幻灯片放在支架上，应用 200 μL 的药物/激酶溶液。将盖玻片放在顶部，以避免蒸发。在烤箱中30°C孵育1小时。 在摇摇器上用 1x TBST + 0.2 M NaCl 清洗幻灯片（每个 3 次 5 分钟）。 重复步骤8.1~8.4，使用原抗体抗磷酸剂抗体稀释1：100。在所有步骤中更换 1x TBST = 5% 牛奶，使用 1x TBST + 3% BSA。 10. 自动杂交协议 注：或者，混合化站可用于自动执行NAPPA阵列上的所有杂交和分纸（第7-9节），协议作为补充文件1提供。 11. 图像采集 注：微阵列图像的分辨率应为20微米或更高。 将微阵列加载到滑动支架盒中，蛋白质朝上。将杂志加载到微阵列扫描仪中。 选择带有 575/30 nm 发射滤波器的绿色激光器，以扫描标有 cy-3 标记的次级抗体的信号。如果使用不同的荧光，请选择正确的激光/波长来检测荧光染料发出的信号。 定义每个图像的名称以及保存它们的位置。 （可选）：对于每种新的荧光，建议优化扫描条件，以检测信号强度的线性范围。为此，请使用一系列光电倍增器 （PMT） 扫描微阵列并获取增益，直到获得具有非饱和信号和低背景的清晰图像。 使用优化的设置扫描所有微阵列，并记住关闭自动增益。注：对于数据分析，应使用相同的扫描设置扫描所有微阵列。对于使用cy3作为荧光剂的激酶测定，使用设备和材料表中列出的扫描仪扫描图像，其PMT为20%，激光强度为25%，分辨率为10微米。 12. 数据处理和分析 注： 有几个软件包可用于量化具有类似功能的微阵列数据。此处描述的过程是为设备和材料表中列出的软件设计的。 加载要量化的 TIFF 文件，设计网格以匹配微阵列布局，并调整点的大小，以将整个信号与尽可能小的区域合并。相邻点不应重叠。目视检查软件的性能，并在必要时手动调整网格。 量化微阵列的信号强度。目视检查这些斑点是否有任何异常（非特异性结合、灰尘等），并将其从数据分析中删除。 使用阵列上不存在点的邻近区域的信号在本地更正背景。 数据规范化。要比较不同阵列的信号，必须标准化每个微阵列的信号强度。要排除任何异常值，请使用从脱磷化微阵列的正控制（IgG 点）中修剪的 30% 信号的均值对数据进行规范化。注：在微阵列的磷酸化和脱磷酸化期间，来自IgG点的信号不会发生变化，适用于规范化。 识别活动激酶。对于微阵列上显示的每个特征，计算自磷化阵列和去磷化阵列中标准化信号强度之间的比率。设置 1.5 倍的阈值以识别有源激酶，并将所有其他特征标记为无法进行自磷酸化 （N/A）。 计算步骤 12.5 中标识的每个激酶的活动，作为调整信号的百分比（归一化正控制阵列 （DMSO） 的信号强度减去归一化负控制阵列（去磷化）的信号强度）。