المقدمة هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين الشكل الأصلي ، بريفيبريلار ، والخلايا الليفية اميلويد ناضجه من الببتيدات مختلفه والبروتينات مع الميتوكوندريا معزولة من الانسجه المختلفة ومناطق مختلفه من الدماغ.
وتشير مجموعه متزايدة من الادله إلى ان الغشاء يتخلله ، بما في ذلك الاغشيه الداخلية مثل الميتوكوندريا ، هو سمه مشتركه واليه الاوليه للسمية الناجمة عن الكلي اميلويد في الامراض التنكسية العصبية. ومع ذلك ، فان معظم التقارير التي تصف أليات اضطراب الغشاء تستند إلى أنظمه نموذجيه فوسفورية ، والدراسات التي تستهدف مباشره الاحداث التي تحدث علي مستوي الاغشيه البيولوجية نادره. وصف هنا هو نموذج لدراسة أليات سميه اميلويد علي مستوي الغشاء. للعزل الميتوكوندريا ، يتم استخدام الكثافة المتوسطة التدرج للحصول علي الاستعدادات مع الحد الأدنى من التلوث الميلين. بعد التاكد من سلامه غشاء الميتوكوندريا ، يتم التحقيق في تفاعل ألياف الليفية اميلويد الناشئة عن α-synuclein ، الانسولين البقري ، والدجاجة البيض الأبيض الليزوزيم (هيول) مع الميتوكوندريا الدماغ الفئران ، كنموذج في المختبر البيولوجية. وتبين النتائج ان علاج الميتوكوندريا الدماغ مع الجمعيات اللييفيه يمكن ان يسبب درجات مختلفه من تغلغل الغشاء وتعزيز المحتوي ROS. وهذا يشير إلى التفاعلات التي تعتمد علي البنية بين ألياف الليفية اميلويد وغشاء الميتوكوندريا. ومن المقترح ان الخصائص الفيزيائية الحيوية من ألياف الليفية اميلويد وملزمه محدده لاغشيه الميتوكوندريا قد توفر تفسيرات لبعض هذه الملاحظات.
الاضطرابات المرتبطة اميلويد ، المعروفة باسم اميلويدسيس ، تشكل مجموعه كبيره من الامراض المحددة من قبل ظهور رواسب البروتين غير القابلة للذوبان في الانسجه المختلفة والاجهزه1،2. ومن بينها ، الاضطرابات العصبية هي الاشكال الأكثر شيوعا التي تظهر المجاميع البروتين في الجهاز العصبي المركزي أو المحيطي2. علي الرغم من انه قد تم اقتراح عدد من أليات للمشاركة في سميه المجاميع اميلويد3، وهناك مجموعه متزايدة من الادله تشير إلى اضطراب غشاء الخلية والتغلغل باعتبارها اليه الرئيسية للامراض اميلويد4، 5– بالاضافه إلى غشاء البلازما ، قد يتاثر أيضا الأرغن الداخلي (اي الميتوكوندريا).
ومن المثير للاهتمام ، تشير الادله الناشئة إلى ان ضعف الميتوكوندريا يلعب دورا حاسما في التسبب في اضطرابات الأعصاب ، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون6،7. وفقا لهذه المسالة, وقد أشارت تقارير عديده ملزمه وتراكم اميلويد β-الببتيد, α-synuclein, huntingtin, و ALS المرتبطة متحولة SOD1 البروتينات إلى الميتوكوندريا8,9,10, 11. ويعتقد ان اليه الغشاء يتخلله المجاميع اميلويد تحدث اما من خلال تشكيل قنوات منفصلة (المسام) و/أو من خلال اليه غير محدده مثل المنظفات5,12, 13-الآن ومن الجدير بالذكر ان معظم هذه الاستنتاجات استندت إلى تقارير تتعلق بنظم نموذجيه فوسفورية ، وان الدراسات التي تستهدف مباشره الاحداث التي تحدث في الاغشيه البيولوجية نادره. ومن الواضح ان هذه الطبقات الدهنية الاصطناعية لا تعكس بالضرورة الخصائص الجوهرية لاغشيه بيولوجية ، بما في ذلك تلك الموجودة في الميتوكوندريا ، والتي هي هياكل غير متجانسة وتتالف من مجموعه واسعه من الدهون الفوسفاتية والبروتينات.
في هذه الدراسة ، يتم استخدام الميتوكوندريا معزولة من أدمغه الفئران كنموذج البيولوجية في المختبر لدراسة الآثار المدمرة من ألياف الليفية اميلويد الناشئة عن α-synuclein (كبروتين اميلويدروني) ، الانسولين البقري (كما يظهر نموذج الببتيد التماثل الهيكلية الكبيرة مع الانسولين البشري المشاركة في الحقن الموضعي الداء النشواني) ، والدجاجة البيض الأبيض الليزوزيم (هيول ؛ كبروتين نموذج مشترك لدراسة تراكم اميلويد). ثم يتم التحقيق في التفاعلات والاضرار المحتملة من اغشيه الميتوكوندريا المستحثة بواسطة ألياف الليفية اميلويد من خلال مراقبه الإفراج عن النازعة مالات الميتوكوندريا (MDH) (الموجود في مصفوفة الميتوكوندريا) والأكسجين الميتوكوندريا التفاعلية تعزيز الأنواع (ROS).
وتدعم ثروة من النتائج التجريبية فرضيه ان السمية الخلوية للييفي المجاميع يرتبط بشكل كبير مع قدرتها علي التفاعل مع ويتخلل الاغشيه البيولوجية4,5. ومع ذلك ، تستند معظم البيانات علي الطبقات الدهنية الاصطناعية التي لا تعكس بالضرورة الخصائص الجوهرية لاغشيه بيولو…
The authors have nothing to disclose.
وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مجلس البحوث التابع لمعهد الدراسات العليا في العلوم الاساسيه ، زانجان ، إيران.
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
Black 96-well plate | Corning | ||
Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
Centrifuge | Sigma | ||
Crystal clear sealing tape | Corning | ||
CuSO4 | Sigma | 451657 | |
Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
EDTA | Sigma | E9884 | |
Fluorescence plate reader | BioTek | ||
Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
Folin | Merck | F9252 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Guillotine | Made in Iran | ||
HCl | Merck | H1758 | |
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
NaOH | Merck | S8045 | |
Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
Percoll | GE Healthcare | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
Quartz cuvette | Sigma | ||
Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
Succinate | Sigma | S2378 | |
Sucrose | Merck | 1076871000 | |
Thermomixer | Eppendorph | ||
Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Tryptone | QUELAB | ||
Water bath | Memmert | ||
Yeast Extract | QUELAB | ||
β-NADH | Sigma | N8129 |