Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

I linfociti intraeliali (IEL) si trovano all’interno dell’epitelio intestinale e si trovano sia lungo la membrana del seminterrato che tra celle epiteliali adiacenti nello spazio intercellulare laterale¹. C’è circa un IEL per ogni 5-10 cellule epiteliali; questi IEL servono come sentinelle per fornire la sorveglianza immunitaria della grande distesa della barriera epiteliale intestinale². Gli IEL che esprimono il recettore delle cellule T (TCR) costituiscono fino al 60% della popolazione totale di IEL nell’intestino piccolo murno. Studi condotti su topi carenti di cellule T dimostrano un ruolo in gran parte protettivo di queste cellule in risposta a lesioni intestinali, infiammazione e infezione^3,4,5. Nonostante la generazione del topo a eliminazione diretta Tcrd ⁶, la nostra comprensione della biologia della IEL rimane limitata in parte a causa del fatto che i ligandi riconosciuti da z – il TCR sono ancora da identificare^{7 .} Di conseguenza, la mancanza di strumenti per studiare questa popolazione cellulare ha reso difficile studiare il ruolo dell’attivazione e della funzione della TCR in condizioni fisiologiche e patologiche. Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato tecniche di imaging dal vivo per visualizzare il comportamento migratorio di IEL e le interazioni con gli enterociti vicini come mezzo per fornire ulteriori informazioni sulla funzione IEL e sulla reattività agli stimoli esterni in vivo.

Nell’ultimo decennio, l’imaging intravitale ha ampliato significativamente la nostra comprensione degli eventi molecolari coinvolti in molteplici sfaccettature della biologia intestinale, tra cui lo spargimento delle cellule epiteliali⁸, regolazione della funzione di barriera epiteliale^{9 ,10}, campionamento di cellule mieloidi del contenuto luminale^11,12e interazioni host-microbe^{11,13,14,15,16} . Nel contesto della biologia IEL, l’uso della microscopia intravitale ha fatto luce sulle dinamiche spatiotemporali della motilità IEL e sui fattori che mediano il loro comportamento di sorveglianza^{13,14,15, 16}. Lo sviluppo del topo reporter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), che etichetta gli IEL con l’espressione nucleare della GFP¹⁷, ha rivelato che gli IEL sono altamente motili all’interno dell’epitelio e presentano un comportamento di sorveglianza unico che risponde al microbico infezione^17,13,14. Recentemente, è stato sviluppato un altro topo di reporter delle cellule T (Tcrd-GDL) che esprime GFP nel citoplasma per consentire la visualizzazione dell’intera cellula¹⁸. Metodologia simile è stata utilizzata per studiare il requisito di recettori chemiochine specifici, come il recettore accoppiato a proteina G (GPCR)-18 e -55, sulla dinamica della motilità IEL^19,20. In assenza di un reporter specifico per le cellule, sono stati utilizzati anticorpi coniugati fluorescenti contro CD8, per visualizzare e tracciare la motilità IEL in vivo^19,20. Sebbene la microscopia a scansione laser a due fotoni sia comunemente utilizzata per l’imaging intravitale, l’uso della microscopia laser confocale confocale a disco rotante offre vantaggi unici per catturare immagini multicanale ad alta velocità e ad alta risoluzione con un minimo rumore di fondo. Questa tecnologia è ideale per chiarire le dinamiche spatiotemporali delle interazioni immuno/epiteliali all’interno del complesso microambiente della mucosa intestinale. Inoltre, attraverso l’uso di vari modelli murini transgenici e/o ad eliminazione diretta, questi studi possono fornire informazioni sulla regolazione molecolare della funzione immunitaria e/o delle cellule epiteliali intestinali.