Génération de neurosphères à partir de neurones hippocampes et corticales primaires mixtes isolées de l'embryon de rat Sprague Dawley E14-E16

Le cerveau est un circuit complexe de cellules neuronales et non neuronales. Pendant des années, les scientifiques ont essayé d’obtenir un aperçu de cette machinerie complexe. Pour ce faire, les neuroscientifiques ont d’abord eu recours à diverses lignées cellulaires à base de nerfs transformées pour des enquêtes. Cependant, l’incapacité de ces lignées cellulaires clonales à former de fortes connexions synaptiques et des axones ou dendrites appropriés ont déplacé l’intérêt scientifique vers les cultures neuronales primaires^1,2. L’aspect le plus excitant de la culture neuronale primaire est qu’il crée une occasion d’observer et de manipuler les neurones vivants³. En outre, il est moins complexe par rapport au tissu neural, ce qui en fait un candidat idéal pour étudier la fonction et le transport de diverses protéines neuronales. Récemment, plusieurs développements dans les domaines de la microscopie, de la génomique et de la protéomique ont généré de nouvelles opportunités pour les neuroscientifiques d’exploiter les cultures neuronales⁴.

Les cultures primaires ont permis aux neuroscientifiques d’explorer les mécanismes moléculaires derrière le développement neuronal, d’analyser diverses voies de signalisation neuronale et de développer une compréhension plus cohérente de la synapse. Bien qu’un certain nombre de méthodes aient rapporté des cultures des neurones primaires (principalement de l’origine hippocampique^5,6,7), un protocole unifié avec un milieu chimiquement défini qui permet la culture à long terme des neurones est encore nécessaire. Cependant, les neurones plaqués à une faible densité sont le plus souvent observés, qui ne survivent pas à long terme, probablement en raison du manque de soutien trophique⁸ qui est fourni par les neurones adjacents et les cellules gliales. Certaines méthodes ont même suggéré la co-culture des neurones primaires avec des cellules gliales, dans laquelle les cellules gliales sont utilisées comme couche d’alimentation⁹. Cependant, les cellules gliales posent beaucoup de problèmes en raison de leur surcroissance, qui l’emportent parfois sur la croissance neuronale¹⁰. Par conséquent, compte tenu des problèmes ci-dessus, un protocole de culture neuronale primaire plus simple et plus rentable est nécessaire, qui peut être utilisé par les neurobiologistes et les neurochimistes pour les enquêtes.

Une culture neuronale primaire est essentiellement une forme de culture 2D et ne représente pas la plasticité, l’intégrité spatiale ou l’hétérogénéité du cerveau. Cela a donné lieu à la nécessité d’un modèle 3D plus crédible appelé neurosphères^11,12. Les neurosphères présentent une nouvelle plate-forme aux neuroscientifiques, avec une ressemblance plus étroite avec le cerveau réel, in vivo¹³. Les neurosphères sont des grappes 3D non adhérentes de cellules riches en cellules souches neurales (NSC), en cellules progénitrices neurales (NPC), neurones et astrocytes. Ils sont une excellente source pour l’isolement des cellules souches neurales et des cellules progénitrices neurales, qui peuvent être utilisées pour étudier la différenciation en diverses lignées neuronales et non neuronales. Encore une fois, la variabilité au sein des cultures de neurosphère produite à l’aide des protocoles précédemment rapportés présente un obstacle à la formulation d’un protocole unifié de culture de neurosphère¹⁴.

Ce manuscrit présente un protocole dans lequel il est possible de générer des plates-formes 2D et 3D en alternant les densités de placage cellulaire à partir d’une culture corticale et hippocampal mixte. On observe que dans un délai de 7 jours, des neurosphères flottantes sont obtenues à partir de neurones plaqués à haute densité isolés de l’embryon de rat E14-E16 Sprague Dawley, qui, sur une autre culture, forment des ponts et des interconnexions par des extensions gliales radiaux. De même, dans les neurones plaqués de faible densité, une culture neuronale primaire qui peut être maintenue jusqu’à 30 jours est obtenue en changeant le milieu d’entretien deux fois par semaine.