Dokosahexaenoic, eicosapentaenoic ve Arachidonik asitlerin Epoxilenmiş metabolitlerinin enzimatik sentezini
Özet
Biz bir yöntem büyük ölçekli enzimatik sentez ve spesifik enantiomerler ve arachidonik asit (AA), dokosahexaenoik asit (DHA) ve eicosapentaenoik asit (EPA) epoksitler regioisomers arıtma için yararlı bir bakteriyel sitokrom kullanımı ile P450 enzim (BM3).
Abstract
Çeşitli çoklu doymamış yağ asitleri (PUFAs), epoksi yağ asitleri olarak adlandırılan, epifon metabolitleri, insan fizyolojisinde rolleri geniş bir yelpazede vardır. Bu metabolitler enzimlerin sitokrom P450 sınıfı ile Endogenously üretilmektedir. Onların farklı ve güçlü biyolojik etkileri nedeniyle, bu metabolitleri okumaya önemli ilgi vardır. Epoksi yağ asitleri ilk olarak önemli miktarlarda elde edilmelidir ve yüksek saflık ile vücutta bu metabolitlerin benzersiz rolleri belirlenmesi, zor bir iştir. Doğal kaynaklardan bileşikler elde genellikle emek yoğun, ve çözünür epokid Hidrolazlar (sEH) hızla metabolitleri hidrolize. Öte yandan, bu metabolitleri kimyasal reaksiyonlar yoluyla elde etmek, saf regioisomers ve enantiomers, düşük verim ve geniş (ve pahalı) arıtma alma zorluk nedeniyle çok verimsizdir. Burada, bir verimli enzimatik sentezi mevcut 19 (s), 20 (r)-ve 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic asitler (EDPS) DHA ile epizidasyon yoluyla bm3, bir bakteriyel CYP450 enzim orijinal Bacillus gelen izole megateryum (Bu kolayca Escherichia coliifade edilir). Karakteristik ve saflık belirlenmesi nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR), yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ve kütle spektrometresi (MS) ile gerçekleştirilir. Bu prosedür, PUFA epoksi metabolitlerinin enzimatik sentezi yararları gösterir ve diğer yağ asitleri, arachidonik asit (AA) ve eicosapentaenoik asit (EPA) dahil olmak üzere, epoksitizi için uygulanabilir asitler (EETs) ve epoxyeicosatetraenoic asitler (EEQs), sırasıyla.
Introduction
İnsan biyolojisinde çok doymamış yağ asitleri (özellikle Omega-3 ve Omega-6 çoklu doymamış yağ asitleri) oynamak rol ilgi son yıllarda büyüdü, araştırmacılar çekici faydaları geniş haber aldı ki onların metabolitleri Sergi. Özellikle, sitokrom P450 enzimlerin sınıfı tarafından üretilen epoksi yağ asidi metabolitleri odak büyük bir noktası olmuştur. Örneğin, birçok PUFA epoxides, epoxyeicosatrienoic asitler (Eets) dahil olmak üzere, epoxydocosapentaenoic asitler (EDPS) ve epoxyeicosatetraenoic asitler (eeqs), kan basıncı ve inflamasyon düzenlenmesi kritik bir rol oynar1,2 , 3 ‘ ü , 4 , 5. ilginçtir, AA ve EPA epoksitler spesifik enantiomerler ve regioisomers vazokonstriksiyon üzerinde değişen etkileri olduğu bilinmektedir6,7. Enantiomerler ve EETs ve EEQs regioisomers fizyolojik etkileri belgelenmiş iken, az benzer epoxydocosapentaenoic asitler (EDPs) etki DHA oluşan etkisi hakkında bilinmektedir. Balık yağı yaygın kullanımı8, EPA ve DHA hem de zengin olan, ayrıca EDPS ilgi karıştırmıştır9. Bu takviyeleri faydaları kısmen aşağı DHA metabolitleri nedeniyle olduğuna inanılmaktadır (16, 17-EDP ve 19, 20-EDP en bol olmak) çünkü EDPs in vivo seviyeleri diyet DHA miktarı ile çok iyi koordine10, 11‘ den itibaren.
Bu epoksi yağ asitlerinin metabolomics, kimyasal biyoloji ve diğer yöntemlerin mekanizmalarını ve hedeflerini incelemek, kısmen, çünkü Regio-ve stereo-izomerlerin karışımları olarak var oldukları ve saf miktarlarda elde etmenin bir yöntemi olan zorlu kanıtlanmıştır enantiomerler ve regioisomers gereklidir. Bu bileşikler kimyasal sentezleme için konvansiyonel araçlar etkisiz olduğunu kanıtladı. Epasetatasyon için meta-chloroperoxybenzoic asit gibi perokasitlerin kullanımı birçok dezavantajları vardır, özellikle de bireysel regioisomers ve enantiomers pahalı ve titizlikle arıtılması gerektiren epidrasyon seçicilik, eksikliği. DHA ve EPA metabolitleri toplam sentezi mümkündür, ama aynı zamanda yüksek maliyetler ve düşük verim gibi büyük ölçekli sentez için pratik yapmak dezavantajları muzdarip12,13. Enzim reaksiyonu Regio-ve stereoseçici14olduğu için, enzimatik sentezle verimli genel üretim elde edilebilir. Çalışmalar, AA ve EPA enzimatik epizemasyon (bm3 ile) hem regioseçici ve enantioseçici15,16,17,18, ama bu prosedür DHA ile test edilmedi, ya da büyük bir gösterir Ölçek. Yöntemimizin genel hedefi, bireysel enantiomerler olarak hızla önemli miktarlarda saf epoksi yağ asitleri üretmek için bu kemoenzimatik epizatasyonu ölçeklendirmek ve optimize etmek oldu. Burada sunulan yöntemi kullanarak, araştırmacılar EDPs ve diğer PUFA epoksi metabolitleri sentezi için basit ve uygun maliyetli bir stratejiye erişebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada DHA-19, 20 ve 16, 17-EDP iki en bol epoksi metabolitleri hazırlamak için operasyonel olarak basit ve maliyet-etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu epoksi yağ asitleri, vahşi tip bm3 enzim kullanarak yüksek enantiomer ( S, R-isomers gibi) şeklinde hazırlanabilir. Sorun giderme için kullanılan çeşitli kritik noktaları ve AA ve EPA enantiomer epoksi metabolitleri hazırlamak için bizim yöntemin uzantısı, aşağıda açıklanmıştır.
BM3 depolama yönergeleri</…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, R00 ES024806 (Ulusal Sağlık Enstitüleri), DMS-1761320 (Ulusal Bilim Vakfı) ve Michigan State University ‘den başlangıç fonları tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar, enzimatik reaksiyon optimizasyonu ve Dr. Tony Schilmiller (MSU Kütle Spektrometrisi ve Metabolomics tesisi) ile ilgili yardım için Dr. Jun Yang ‘a (Davis ‘de California Üniversitesi) ve Lalitha Karchalla ‘ya (Michigan Devlet Üniversitesi) teşekkür etmek istiyor HRMS veri edinme ile ilgili yardım için.
Materials
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
Referanslar
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. . Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. . Method for the synthesis of DHA. , (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- . Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019)
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
