Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares
Özet
Clonamos y analizamos genes de reportero generando ARN circulares. Estos genes reporteros son más grandes que las construcciones para analizar el empalme lineal y contener elementos Alu. Para investigar los ARN circulares, las construcciones se transinfectan en células y el ARN resultante se analiza utilizando RT-PCR después de la eliminación del ARN lineal.
Abstract
Además de los ARNm lineales, muchos genes eucariotas generan ARN circulares. La mayoría de los ARN circulares se generan uniendo un sitio de empalme de 5′ con un sitio de empalme ascendente de 3′ dentro de un pre-mRNA, un proceso llamado back-splicing. Esta circularización es probablemente ayudada por estructuras secundarias en el pre-mRNA que acercan los sitios de empalme. En los genes humanos, se piensa que los elementos Alu promueven estas estructuras secundarias de ARN, ya que los elementos Alu son abundantes y exhiben complementariedades de base entre sí cuando están presentes en direcciones opuestas en el pre-ARNm. Aquí, describimos la generación y el análisis de grandes elementos Alu que contienen genes de reportero que forman ARN circulares. A través de la optimización de los protocolos de clonación, se pueden generar genes de reportero con una longitud de inserción de hasta 20 kb. Su análisis en experimentos de co-transfección permite la identificación de factores regulatorios. Por lo tanto, este método puede identificar secuencias de ARN y componentes celulares involucrados en la formación de ARN circular.
Introduction
RNA circulares
Los ARN circulares (arnar circ) se cierran covalentemente en ARN de una sola trenza que se expresan en la mayoría de los organismos. Se generan uniendo un sitio de empalme descendente de 5′ a un sitio de empalme ascendente de 3′, un proceso llamado back-splicing(Figura 1A)1. Las secuencias en el pre-mRNA que exhiben base complementaria tan corta como 30-40 nt llevan los sitios de empalme hacia atrás en la alineación adecuada para la formación de ARN circn.2. En los seres humanos, los elementos Alu 1, que representan alrededor del 11% del genoma3,forman extensas estructuras de ARN de doble cadena en pre-arNM debido a su autocomplementariedad4,5 y así promueven la formación de circRNAs1.
Actualmente, se han descrito tres funciones principales de los circRNAs. Algunos círculos se unen microRNAs (miRNAs) y a través del secuestro actúan como esponjas de miRNA6. Los CircRNAs se han implicado en la regulación transcripcional y post transcripcional, a través de la competencia con el empalme lineal7 o la modulación de la actividad del factor de transcripción8. Por último, los círculos contienen marcos de lectura abiertos cortos y estudios de prueba de principio muestran que se pueden traducir9,10. Sin embargo, la función de la mayoría de los círculos narinás sigue siendo enigmática. La mayoría de los ARN circulares se han detectado utilizando métodos de secuenciación de próxima generación11. Los análisis detallados de genes individuales utilizando enfoques RT-PCR específicos revelan que un gran número de ARN circulares aún está por descubrir12.
Uso de genes reportero según el procesamiento previo al ARNm
El análisis del ARNm derivado de construcciones de reporteros de ADN transfectó en células es un método bien establecido para estudiar el empalme alternativo antes del ARNm, que se puede aplicar a los ARN circulares. En general, el exón alternativo, sus intrones circundantes y exons constitutivos se amplifican y clonan en un vector de expresión eucariota. Con frecuencia, los intrones se acortan. Las construcciones están infectadas en células eucariotas y generalmente analizadas por RT-PCR13,14. Este enfoque se ha utilizado ampliamente para mapear sitios de empalme sregulador y factores de acción trans en experimentos de co-transfección13,15,16,17,18. Además, la generación de minigenes de expresión de proteínas permitió el cribado de sustancias que cambian el empalme alternativo19,20.
El método se ha aplicado a los ARN circulares. Actualmente, al menos 12 espina dorsales de minigene se han descrito en la literatura y se resumen en la Tabla 1. Con la excepción del sistema de expresión basado en ARNm21,22, todos dependen de los promotores de la polimerasa II. Aquí, describimos un método para generar minigenes de reporteros humanos para determinar los factores cis y trans-acting involucrados en la generación de ARN circulares. En la Figura 1se muestra una descripción general del método utilizando secuencias de un gen de reportero publicado23.
Protocol
Representative Results
Discussion
En general, los ARN circulares son de bajo abundante1, lo que complica el estudio de su función y formación. Al igual que los ARN lineales13,el uso de minigenes de reportero permite la identificación de cis y factores de acción trans que regulan la formación de ARN circulares. Por lo tanto, este enfoque genera hipótesis que se pueden probar aún más utilizando los genes endógenos.
El paso más crítico es el diseño del gen reportero. El …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la concesión AZ180075 del Departamento de Defensa. Stefan Stamm gracias Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin fue apoyada por el DAAD, programa de intercambio académico alemán, Justin R. Welden fue galardonado con el Premio de la Universidad de Kentucky Max Steckler.
Materials
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
| Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
| Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
| Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
| Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
| Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
| Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
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