Se presenta un protocolo para la preparación de células líquidas de micropozo compatibles con grafeno para microscopía electrónica in situ de nanocristales de oro de la solución precursora HAuCl4. Además, se presenta una rutina de análisis para cuantificar la dinámica observada de grabado y crecimiento.
La fabricación y preparación de células líquidas de micropozo sin grafía (GsmLC) para microscopía electrónica in situ se presenta en un protocolo escalonado. La versatilidad de los GSMLC se demuestra en el contexto de un estudio sobre la dinámica de grabado y crecimiento de nanoestructuras de oro a partir de una solución precursora HAuCl 4. Los GSMLC combinan las ventajas de las células líquidas convencionales a base de silicio y grafeno al ofrecer profundidades de pozo reproducibles junto con la fabricación y manipulación de células fáciles de la muestra bajo investigación. Los GSMLC se fabrican en un solo sustrato de silicio que reduce drásticamente la complejidad del proceso de fabricación en comparación con los diseños de células líquidas basadas en dos obleas. Aquí, no se requieren pasos de proceso de unión o alineación. Además, el volumen de líquido cerrado se puede adaptar a los requisitos experimentales respectivos simplemente ajustando el espesor de una capa de nitruro de silicio. Esto permite una reducción significativa del abultamiento de la ventana en el vacío del microscopio electrónico. Por último, se presenta una evaluación cuantitativa de última generación de seguimiento de partículas únicas y formación de dendrita en experimentos de células líquidas utilizando sólo software de código abierto.
La ciencia de los materiales modernos, la química y la biología celular requieren una comprensión profunda de los procesos y efectos dinámicos subyacentes a escala submicrones. A pesar del poder de las técnicas avanzadas de microscopía óptica, como la microscopía de fluorescencia de agotamiento de emisiones estimuladas1,las técnicas de imagen directa para acceder a morfologías detalladas requieren microscopía electrónica. En particular, se ha demostrado que la microscopía electrónica de transmisión in situ (escaneo) (S)TEM ilumina información valiosa sobre la dinámica de los procesos encapsulando líquidos en células dedicadas y herméticas al vacío2. Diversos experimentos como investigaciones cuantitativas de la formación de nanoestructuras cinética y termodinámica3,4,5,6, imágenes de muestras biológicas7, 8 , 9 , 10 y estudios de los mecanismos relacionados con el almacenamiento de energía11,12 junto con estudios exhaustivos de la dinámica del proceso de corrosión13 o nanoburbuja física14,15, 16 han desentrañado muchos fenómenos utilizando (S)TEM que no eran accesibles utilizando técnicas de microscopía estándar.
Durante la última década, se han establecido dos enfoques principales para realizar teM de células líquidas in situ (LCTEM). En el primer enfoque, el líquido se encapsula en una cavidad entre dos membranas Si3N4 producidas a través de la tecnología de proceso Si17,mientras que en la segunda, se forman pequeñas bolsas líquidas entre dos láminas de grafeno o óxido de grafeno 10,18. La manipulación tanto de células líquidas a base de silicio (SiLC) como de células líquidas a base de grafeno (GLC) se ha demostrado19,20,21. Aunque ambos enfoques han sufrido mejoras significativas22,23,24,25,todavía carecen de la combinación de las ventajas respectivas. En general, existe un equilibrio entre encapsular la muestra en bolsillos de grafeno a menudo indefinidos con un pequeño volumen de líquido que permite imágenes de alta resolución18,y volúmenes celulares bien definidos que dan como resultado membranas más gruesas y capas líquidas, que proporcionan un entorno más cercano a la situaciónnatural en el líquido a granel26 a expensas de la resolución 2. Además, algunos experimentos dependen de un flujo líquido26,27 que sólo se ha realizado en arquitecturas SiLC y requiere un soporte TEM dedicado28.
Aquí, presentamos la fabricación y manipulación de un enfoque de células líquidas para LCTEM in situ de alto rendimiento a través de células líquidas de micropozo sostenitos compatibles con grafeno (GSMLCs) para análisis TEM. En la Figura 1se presenta un boceto de la GSMLC. Los GLOC han demostrado ser capaces de permitir resultados in situ de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM)6 y también son factibles para la microscopía electrónica de barrido in situ 29. Su marco basado en la tecnología Si permite la producción en masa de células con forma reproducible con espesor líquido a medida y membranas extradelgadas de una sola oblea. La membrana de grafeno que cubre estas célulastambién mitiga las perturbaciones inducidas por haz de electrones 8,30,31 ya que el haz de electrones pasa primero a través de la membrana superior del grafeno. La topografía plana de las células permite métodos de análisis complementarios como la espectroscopia de rayos X de dispersión energética (EDXS)6 sin efectos de sombra derivados de la propia célula líquida, lo que permite una variedad de in situ de alta calidad experimentos de microscopía electrónica de células líquidas.
A diferencia de las células líquidas disponibles en el comercial, los SGSM hechos a medida tienen la ventaja de que se pueden diseñar para caber en soportes TEM fácilmente disponibles y no requieren un costoso soporte TEM de celda líquida dedicado.
La arquitectura GSMLC demostrada aquí combina aspectos de SiLC y GLC que potencialmente podrían conducir a ventajas únicas. Por un lado, los SiLC permiten una determinación precisa de la posición y la forma de la célula, pero requieren membranas Si3N4 relativamente gruesas para reducir los efectos de abultamiento y, en última instancia, reducir la resolución alcanzable. Los GLC, por otro lado, exhiben paredes de membrana excepcionalmente delgadas que consisten en grafeno, pero sufren de tamaños y posiciones de bolsillo aleatorios. Mediante la combinación de estos dos enfoques de membrana a través de GSMLCs, la limitación de resolución causada por los límites celulares35 se puede omitir. Como la estructura del pozo se fabrica directamente en la capa Si3N4, la membrana Si3N4 real se puede construir incluso más pequeña que en los SiLC, simplificando los análisis HRTEM que ya se ha demostrado en GSMLCs6 . Aún así, cabe señalar que HRTEM en general es posible con Los SiLCs, asícomo 48. Además, grandes áreas de visualización se pueden realizar sin abultamiento severo de ventanas debido a las pequeñas áreas de membrana de las cámaras de muestras individuales. De este tipo, el aumento del espesor relacionado con el abultamiento35 se puede descartar en gran medida, como lo muestran los duques y otros49. Esto se muestra en la Figura7, donde se muestra una imagen STEM de campo oscuro anular de ángulo alto (HAADF) representativa de al cargado GSMLC. Esta imagen fue adquirida usando un sistema de doble viga. Dado que el brillo de la imagen adquirido en esta configuración está directamente relacionado con el grosor de la muestra, es claramente visible que los micropozos sellados exhiben sólo pequeños abultamientos negativos. 24 han demostrado que el abultamiento negativo y el secado parcial del pozo visible en la Figura 7 depende del diámetro del pozo. Reducir el diámetro del pozo es, por lo tanto, un enfoque factible para homogeneizar aún más el espesor del líquido.
Debido a la forma de bolsillo de equilibrio de los GLC, el espesor del líquido también depende en gran medida del sitio35. Los SiLC siguen el diseño de dos membranas derivadas de diferentes obleas Si. Al reemplazar la membrana superior Si3N4 por grafeno, se simplifica la fabricación de células líquidas. Esto significa que se puede evitar la posible delaminación de dos Si-wafers unidos durante los siguientes pasos de grabado húmedo y se omite la alineación de dos piezas de obleas durante la carga celular. La superficie plana en un lado de esta arquitectura celular permite métodos de análisis in situ complementarios como el análisis EDXS de la muestra6,que está restringido en las arquitecturas SiLC convencionales por efectos de sombra en bordes Si empinados50 .
El sellado de micropozos prepatrónizados con grafeno tanto en la parte inferior como en la parte superior del pozo se ha demostrado antes de24,25. La aplicación de dos membranas de grafeno puede mejorar la resolución alcanzable. Una doble transferencia de grafeno, sin embargo, complicaría aún más el proceso de preparación; sobre todo porque este ha demostrado ser el paso de preparación más sensible (ver más abajo). Además, se espera que el abultamiento de membrana discutido anteriormente sea aún más crítico en el caso de dos membranas de grafeno, porque el grafeno es mucho más flexible que una capa de Si3N4. En esas arquitecturas, los micropozos se construyeron utilizando fresado secuencial de haz iónico enfocado (FIB). Si bien este enfoque ha demostrado producir resultados de alta calidad, el fresado FIB es una técnica de producción celular complicada y costosa. Sin embargo, el uso de técnicas de patrón de un solo disparo masivamente paralelas que ya son estándar en la industria de semiconductores de hoy en día, como la nanoimpresión o la fotolitografía, tiene la principal ventaja de ser rápido, barato y escalable para la producción en masa.
Cabe señalar que el enfoque aquí presentado no permite la operación del flujo de líquido, lo que es alcanzable por otros dibujos y modelos28. Dado que la carga y el volumen de líquido son comparables para GSMLCys y GLCs, se puede evitar una contaminación de alto vacío debido a la rotura de la membrana19. Esto elimina la necesidad de una comprobación de sello engorrosa. Aunque se han combinado las ventajas de los SiLC y los GLC, las desventajas de ambos enfoques siguen estando presentes en los GSMLC. La fabricación de las células requiere una infraestructura de salas limpias para la tecnología de silicio, que no está necesariamente presente en los laboratorios TEM. Además, la carga de líquidos no es trivial. Requiere un entrenamiento dedicado, similar a las células de grafeno. Sin embargo, esto también es cierto para los sistemas disponibles comercialmente. Aquí, el paso de preparación más sensible es la eliminación de TEM-grid después de la transferencia de grafeno porque es probable que los movimientos de erupción o el nerviosismo rompan la capa Si3N4. Las ventanas de membrana redundantes, sin embargo, mejoran las posibilidades de preservar al menos un área de membrana. Como consecuencia, el rendimiento (cantidad de chips GSMLC operables) logrado por unexperimentador entrenado es de tres de cuatro 6, y por lo tanto supera el alcanzado con células basadas en grafeno (uno a dos de cuatro)19.
Al igual que con los GLC, la encapsulación líquida en GSMLCs se basa en las interacciones van-der-Waals18. En consecuencia, la contaminación de la interfaz podría reducir la tasa de éxito en el procesamiento de GSMLCs19. Además, dependiendo de la constante Hamaker de la fase líquida a encapsulada, las características de humectación durante el procedimiento de carga (y por lo tanto el rendimiento alcanzable) pueden diferir51 y por lo tanto la preparación puede ser complicada. Nuestra experiencia muestra que este es el caso si, por ejemplo, las especies anfifílicas están presentes.
La arquitectura GSMLC permite una configuración flexible de profundidades, lo que permite adaptarse a varios requisitos previos experimentales. Por otra parte, la arquitectura es adecuada para las investigaciones de tomografía electrónica en un amplio rango de ángulo de inclinación de 75o, lo que también permitiría la tomografía de electrones in situ 52. Por lo tanto, la tomografía in situ y post mortem de la muestra en líquido también podría establecerse con GSMLCs.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Tilo Schmutzler por la preparación de la solución HAuCl 4. Además, agradecemos a R. Christian Martens por la lectura de pruebas. Apoyo financiero de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través del Grupo de Formación de Investigación GRK 1896 “Microscopíain situ con electrones, rayos X y sondas de escaneo” y a través del Cluster of Excellence EXC 315/2 EAM “Ingeniería de Materiales Avanzados” es agradecido reconocido.
Acetone | VWR Chemicals | 50488858 | VLSI |
Deionized water | own production | ||
Dumont Anti-Capillary tweezers | Carl Roth GmbH + Co. KG | LH72.1 | 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed |
Ethanol | VWR Chemicals | 85651.360 | VLSI |
FIJI Is Just ImageJ | FIJI.sc | Version 1.51 | |
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids | Plano GmbH | S173-8 | R 2/2 Au 300 mesh |
HAuCl4 · 3 H2O crystal | Alfa Aesar | 36400.06 | 5 g |
Jupyter Notebook | Project Jupyter | Version 5.7.2 | |
Matplotlib-Package | John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team | Version 3.0.2 | |
NumPy-Package | NumPy developers | Version 1.15.4 | |
Pandas-Package | AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team | Version 0.23.4 | |
Python | Python Software Foundation | Version 3.7 | |
Scipy-Package | SciPy developers | Version 1.1.0 | |
Seaborn-Package | Michael Waskom | Version 0.9.0 | |
Si wafer | Siegert Wafer GmbH | Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished | |
single tilt TEM holder | Philips | Ensure that cell fits | |
Transmission Electron Microscope | Philips | CM 30 (S)TEM | 300 kV |
Trivial Transfer Graphene | ACS Material | TTG60011 | PMMA-covered, 6 — 8 MLs |