Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos
Özet
Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.
Abstract
A apoptose celular é um processo natural e desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário, na regulação homeostática, na indução da tolerância imune e na resolução da inflamação. O acúmulo de detritos apoptóticos no corpo pode desencadear respostas inflamatórias crônicas que levam a doenças auto-imunes sistêmicas ao longo do tempo. O afastamento de pilha apoptóticas danificado foi implicado em uma variedade de doenças auto-imunes. A depuração apoptótica é um processo complexo raramente detectado em condições fisiológicas. Envolve receptores de superfície abundantes e moléculas de sinalização. Estudar o processo de liberação de células apoptóticas fornece mecanismos moleculares perspicazes e respostas biológicas subsequentes, o que pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas. Aqui, nós descrevemos protocolos para a indução de thymocytes apoptóticas, a preparação de macrófagos peritoneais, e a análise do afastamento de pilha apoptóticas pelo fluxo citometria e pela microscopia. Todas as células serão submetidas a apoptose em um determinado estágio, e muitas células residenciais e circulantes podem captação de detritos apoptóticos. Portanto, o protocolo descrito aqui pode ser usado em muitas aplicações para caracterizar a ligação e a ingestão de células apoptóticas por muitos outros tipos de células.
Introduction
Nosso corpo gera 1-10 bilhões de células apoptóticas em uma base diária. Um número tão grande de pilhas apoptóticas deve ser cancelado de uma maneira que as respostas imunes permaneçam quiescentes. Para garantir o despejo de células apoptóticas em tempo hábil, inúmeros tipos de células residentes no tecido e células circulantes desenvolvem mecanismos para engolfo células apoptóticas1. A regulação disfuncional da apoptose tem sido implicada no início e progressão de várias doenças inflamatórias e autoimunidade2. A apoptose também desempenha um papel crítico na patogênese do desenvolvimento do câncer e sua subsequente resistência aos tratamentos convencionais3,4. A remoção de células apoptóticas geralmente promove uma resposta anti-inflamatória, que pode estar ligada à tolerância imunológica5. A violação do afastamento de pilha apoptóticas conduz o Self-imunização e contribui ao desenvolvimento de doenças auto-imunes sistemáticas em seres humanos e em ratos6.
Quando as células passam por apoptose, elas expõem a fosfatidilserina (PtdSer) do folheto interno ao folheto externo da membrana. O PtdSer será então reconhecido pelos fagócitos através de receptores de superfície. Mais de uma dúzia de receptores foram identificados para reconhecer e/ou facilitar o engulfment de células apoptóticas. Em geral, há pelo menos três tipos de receptores de superfície envolvidos na depuração celular apoptótica: receptores tethering, reconhecem células apoptóticas; fazer cócegas nos receptores, iniciar o engulfment; os receptores de chaperoning, facilitam o processo inteiro7. As tirosina cinases do receptor TAM (TAM RTKs) consistem em Tyro-3, AXL e Mer e são expressas principalmente por células mielóides do sistema imunológico8. A função primária de TAM RTKs é servir como receptores tethering, facilitando a remoção fagocítica de células apoptóticas e detritos. Nosso grupo tem estudado o afastamento de pilha apoptóticas negociado Tam no ajuste da autoimunidade por muitos anos. A proteína de crescimento protéico dependente de vitamina K 6 (Gas6) e proteína S (prós) vincula e ativa os receptores de Tam9,10. Gas6 é produzido no coração, rins e pulmões. ProS é produzido principalmente no fígado11. TAM reconhece de células apoptóticas de tal forma que o N-terminal de Gas6/ProS se liga ao PtdSer em uma célula apoptótica e o C-terminal de Gas6/ProS se liga aos receptores TAM que ancorados na superfície dos fagócitos. Juntamente com os outros receptores, a engulfment de células apoptóticas ocorre12. Embora o Mer possa se vincular tanto aos ligantes ProS e Gas6, descobrimos que Gas6 parece ser o único ligador para a fagocitose de macrófagos mediada por Mer de células apoptóticas, que podem ser bloqueadas pelo anticorpo anti-Mer13. Os macrófagos são fagócitos profissionais. O afastamento rápido de pilhas apoptóticas por macrófagos é importante para a inibição da inflamação e de respostas auto-imunes de encontro aos antígenos intracelular. A tirosina quinase do receptor de Mer é crítica para o engulfment do macrófago e o afastamento eficiente de pilhas apoptóticas14. No baço do camundongo, Mer expressa principalmente sobre a zona marginal e os macrófagos corpóreos13.
O protocolo aqui apresentado descreve um método básico para induzir a apoptose celular e demonstrar formas de mensurar o processo e a eficiência da eferocitose. Estes protocolos podem prontamente ser adaptados para estudar o macrófagos por outros tipos da pilha no engulfment de pilhas apoptóticas de origens diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A apoptose é um processo de morte celular altamente conservado que envolve muitas cascatas de sinal e induz expressão protéica, secreção e transporte. A apoptose é frequentemente associada a alterações morfológicas celulares17. Células apoptóticas liberam ativamente citocinas e quimiocinas que atraem fagócitos para migrar para o local e iniciar o processo de engulfment, uma via extremamente complexa controle apertado18. Por outro lado, a morte celular necrótica…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa no laboratório de Shao é apoiada pela concessão inovativa da pesquisa da faculdade da medicina e da faculdade Júnior concessão do piloto do departamento da medicina interna, Universidade de Cincinnati e concessão DK K01_095067 de NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
Referanslar
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
