El muestreo sanguíneo continuo en tomografía por emisión de positrones de animales pequeños permite la medición de la función de entrada arterial

Todos los experimentos y manejo de animales fueron aprobados por el Comité Estatal de Investigación Animal de Mecklemburgo-Pomerania Occidental (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, aprobación: 03.04.2018). Los experimentos se realizaron de conformidad con las Directrices de ARRIVE. NOTA: Los animales se mantuvieron en condiciones estándar (22 oC, ciclo de 12 h día y noche) con agua y comida ad libitum. Todos los equipos necesarios para la preparación del sistema de derivación, el procedimiento de operación y las mediciones reales se enumeran en la Tabla de materiales. 1. Preparación y procedimiento quirúrgico para el cateterismo del animal Ayuna rinde al animal durante al menos 12 h con acceso gratuito al agua. Para la anestesia, coloque la rata en una cámara de inducción y llénela continuamente con mezcla de oxígeno/isoflurano. Para el inicio utilizar 2.5-3.5% isoflurano y para mantenimiento 1.5-3.0% (tasa de flujo de 1.2-1.5 L/min).NOTA: El ayuno es necesario para los estudios que utilizan el trazador [18F]FDG pero no para otros trazadores. Se recomienda medir los niveles de glucosa en sangre mediante extracciones de sangre manuales descritas en la sección 4 para garantizar valores estables o para corregir en el modelado cinético. Coloque la rata anestesia en posición dorsal sobre una estera de calentamiento, debajo del microscopio quirúrgico y agregue un pomada de ventosa en sus ojos. Supervise y mantenga la temperatura corporal de la rata continuamente durante el experimento (37 o 0,5 oC) con una sonda rectal. Pegue las patas de la rata a la superficie de trabajo para mantener las piernas en posición. Desinfectar el lugar de operación con un desinfectante de la mucosa y afeitar la pierna y la entrepierna (lado de la operación) de la rata. Terminar con una limpieza final con el desinfectante. Haga una incisión de unos 20 mm usando fórceps quirúrgicos y tijeras en la ingle de la rata. Disecciona las capas finas de la piel y expone la vena femoral, la arteria y el nervio con los micro fórceps. Coloque dos filamentos finos debajo de cada vena femoral y arteria. Selle la vena y la arteria con cada filamento distal y mantenga bajo tensión con una abrazadera bulldog.Utilice los filamentos de sutura proximal para tensar el vaso utilizando las abrazaderas bulldog (sin nudo). Bloquee la vena con una abrazadera de aneurisma proximal, pero distal de 2-3 mm de la sutura con la abrazadera bulldog. Use tijeras corneales para hacer una pequeña incisión en la vena (1/3 del diámetro) y retire la sangre con fugas de algodón con un intercambio de algodón estéril. Dilatar la vena con un fórceps opaco y mantenerla abierta. Inserte el catéter afilado (diámetro interno [ID]: 0,58 mm, diámetro exterior [OD]: 0,96 mm) en la vena y empújelo en dirección proximal, hasta el clip de aneurisma. Abra el clip del aneurisma y empuje el catéter más lejos en dirección proximal (aproximadamente 2-3 cm), si el catéter se coloca a la derecha, la sangre fluirá hacia el catéter. Asegure el catéter con la sutura proximal haciendo dos nudos; si es necesario, coloque una sutura adicional alrededor de la vena y el catéter. Compruebe la funcionalidad del catéter lavando y aspirando con una jeringa de insulina (30 G de aguja) llena de 100 ml de solución salina heparinizada (50 unidades/ml). Coloque el catéter en la arteria repitiendo los pasos 1.6 y 1.7. Cuando ambos catéteres estén colocados correctamente, cierre la pierna con suturas y lleve al animal al PET/CT.NOTA: Tenga el más cuidado posible con los catéteres durante el transporte del animal, de lo contrario podría producirse un cambio del catéter. 2. Configuración del sistema de derivación Figura 2 : Esquema de la configuración de medición. (A) Dibujo esquemático de la configuración de medición. (B) Foto del sistema de derivación conectado con el detector de twilite, bomba peristáltica y diferentes tipos de conectores. El tiempo de radiactividad en la sangre de una rata se detecta mientras el animal (1) se escanea en el PET/CT (2). Por lo tanto, el catéter arterial (a) y venoso (b) está conectado al sistema de bomba detector a través de piezas adaptadoras (conector naranja, conector azul y conector verde). La sangre arterial se bombea desde el catéter arterial a través del detector (3) a una bomba peristáltica (4) y de vuelta al cuerpo a través del catéter venoso. Una válvula de 3 vías (7) está integrada en el sistema de tubos para realizar la inyección del trazador, extracciones de sangre manuales y enjuaguezmiento. Se monta una pieza en T (8) para inyectar actividad. El detector está conectado con un ordenador para ver, calibrar y corregir los datos sanguíneos continuos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Cortar 6 partes del tubo de polietileno de diámetro fino (FBPT) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) con una longitud de c a 735 mm; e á 100 mm; f á 171 mm, g a 875 mm; h a 90 mm e i a 75 mm (Figura2). Corte 8 partes de los tubos de la bomba de silicona (negro/negro/negro, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) con una longitud de aproximadamente 20 mm. Coloque los conectores de reducción (de ID 2,5 mm a ID 1,5 mm) en ambos extremos del tubo de la bomba de silicona d (amarillo/azul/amarillo, ID: 1,52 mm, OD: 3,20 mm). Coloque una parte preparada de 20 mm de los tubos de silicona (negro/negro/negro) en el otro extremo de los conectores de reducción utilizados (consulte el conector azul en la Figura 2). Coloque la parte preparada c del FBPT en el conector montado azul en el extremo del tubo de la bomba de silicona d (amarillo/azul/amarillo) y la parte preparada e del FBPT en el conector montado azul en el otro extremo. Coloque una parte preparada de 20 mm de los tubos de silicona (negro/negro/negro) en los extremos de dos piezas en T 5 y 6 (ID del conector en T del tubo: 1,5 mm; véase el conector verde en la Figura 2). Conecte el extremo libre de la parte e del FBPT al lado izquierdo del conector montado en verde (5) y coloque la parte preparada f del FBPT en el lado opuesto del conector verde (5). Coloque el extremo libre de la parte f del FBPT en el lado izquierdo del conector montado verde (6) y coloque la parte preparada g del FBPT en el lado opuesto del conector verde (6). Agregue la parte preparada h del FBPT al extremo libre del conector montado verde (5) y la parte preparada i del FBPT al extremo libre del conector montado verde (6). Conecte un combi-stopper a una aguja hipodérmica (G 23 x 1 1’4”/a 0,60 mm x 30 mm) y agréguelo a una válvula de tres vías. Coloque la válvula de tres vías preparada con la aguja en el extremo libre de la parte h del FBPT. Conecte un combi-stopper a una aguja hipodérmica y coloque la aguja en el extremo libre de la parte i del FBPT.NOTA: Antes de iniciar el muestreo de sangre en línea, ver sección 5. Coloque los extremos libres de las partes c y g del FBPT en un vaso de precipitados de 100 ml lleno de 20 ml de solución salina heparinizada (50 unidades/ml). Encienda la bomba peristáltica con un caudal de 1,52 ml/min para que el sistema de derivación esté completamente lleno de la solución salina fisiológica. A continuación, ponga tres abrazaderas de tijera en los extremos de la parte c y g y en el centro de la parte i del FBPT. Suelte las abrazaderas de tijera de las partes c y g del FBPT. Conecte el catéter arterial al extremo libre de la parte c del FBPT y conecte el catéter venoso b al extremo libre de la parte g del FBPT (consulte el conector naranja en la Figura 2). 3. Adquisición y reconstrucción de imágenes Coloque al animal en posición propensa a la cabeza en el palé de la cama lanzadera (70 mm). Controle la respiración de la rata y mantenga la temperatura corporal a 37 oC a 37 oC utilizando una almohadilla de calentamiento y una sonda rectal durante la adquisición de la imagen. Mueva la cama lanzadera a la posición de la cama extendida para inyección (pre-adquisición) y conecte los catéteres insertados al sistema de derivación. Mantener al animal bajo anestesia con isoflurano (2,5% de isoflurano en oxígeno, caudal 1,2-1,5 L/min) a través de un cono nasal. Encienda la bomba peristáltica con un caudal de 1,52 ml/min para llenar el sistema de derivación con la sangre del animal. Mueva la cama lanzadera al centro del campo de visión del anillo de detección de PET e inicie el sistema de muestreo de sangre en línea (ver sección 5). Iniciar el flujo de trabajo PET/CT utilizando los parámetros descritos en la sección 3.5 después de 60 s y, posteriormente, inyectar una dosis de aproximadamente 22 MBq [18F]FDG en un volumen de aproximadamente 0,5 a 0,1 ml por vía intravenosa a través de la pieza T. Enjuague la pieza en T con unas 150 ml de solución salina heparinizada después. Adquiera un PET dinámico de más de 60 minutos y una tomografía computarizada al final de la imagen por PET. Para la adquisición de emisiones de PET, establezca 3600 s (60 min) en la opción de adquirir por tiempo. Seleccione F-18 como isótopo de estudio y utilice 350–650 keV como nivel de energía y 3.438 ns como ventana de sincronización. Para la adquisición de TC, seleccione la exploración de atenuación en la opción de adquisición. En el campo de configuración de proyección, seleccione 120 proyecciones para una rotación totalde la mitad. Para los ajustes de campo de visión (FOV) y resolución, seleccione bajo como aumento y 4 x 4 como encuadernación con longitud de escaneo axial de 275 mm y 3328 px como tamaño CCD transaxial. En el campo de ajustes de exposición, ajuste 500 oA para corriente, 80 kV para tensión y 180 ms para el tiempo de exposición. Para el histograma de emisión PET, establezca una serie de 20 fotogramas (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s y 1 x 1800 s) como encuadredinámico. Seleccione Restar como retardos. Elija en el campo de configuración avanzada 128 como ancho de sinograma, 3 como intervalo, 79 como diferencia de anillo y correcciónde tiempo muerto. Para la reconstrucción de PET, utilice la maximización de la expectativa de subconjunto ordenada bidimensional (2D-OSEM) con un sinogramade generación, aplicación y guardado, 4 iteraciones y Fourier para rebinning como algoritmo de reconstrucción. Seleccione 128 x 128 como tamaño de matriz y utilice 1 como zoomde imagen, todos como fotogramas y todos como segmentos. 4. Procedimiento de muestreo manual de sangre Realice muestreos de sangre manuales de 30 s, 60 s, 90 s, 600 s y 1800 s después de iniciar la adquisición de imágenes.NOTA: Si es posible, se recomienda aumentar el número de extracciones de sangre manuales, especialmente en el primer minuto después de la inyección del trazador. Por lo tanto, el volumen de la muestra de sangre debe reducirse a 20-30 l por muestra6. Abra la primera válvula de tres vías y recoja 100 ml de sangre arterial en un tubo EDTA de recolección de sangre capilar 30 s después de la inyección del trazador. Repita el proceso para los demás puntos de tiempo. Determine el peso del tubo vacío y el tubo lleno de sangre. Mida la actividad (cuentas/unidad de tiempo) de toda la sangre durante 180 s en un contador de pozos, que posteriormente se calibra cruzadamente para obtener datos en kBq/mL. Registre la hora de inicio de la medición del contador de pozos. Calcular la actividad de sangre entera para cada punto de tiempo del muestreo de sangre manual en kBq/mL, aplicar la corrección de descomposición y transferir los datos en una curva de actividad de tiempo. 5. Procedimiento del muestreo de sangre en línea Coloque el tubo en el detector utilizando la guía del tubo. Inicie el software de muestreador de sangre (por ejemplo, PSAMPLE) y abra la interfaz de adquisición. Asegúrese de que el ordenador de la configuración de muestreo de sangre en línea y del PET/CT esté sincronizado en el tiempo. Pulse el botón de inicio exactamente 60 s antes de inyectar el trazador para adquirir suficientes datos para la corrección en segundo plano. Guarde los datos sin procesar a través del botón Guardar en la base de datos PMOD después de la medición. Para la corrección y calibración de los datos de sangre en línea, cambie a la interfaz de corrección. Habilite la corrección de decaimiento y seleccione 18 F. Defina la hora de inicio de la adquisición de la imagen y habilite el botón promedio para realizar la corrección de fondo. Active la calibración y escriba el factor de calibración previamente determinado (ver sección 7.1). Guarde los datos sanguíneos corregidos y calibrados utilizando el botón Guardar TAC y elija el archivo blood.crv. Este archivo se puede cargar como curva de entrada de sangre completa en la herramienta de modelado cinético y se puede realizar el modelado cinético. Desacople los catéteres del sistema de derivación corporal adicional. Separar al animal del escáner PET/CT y eutanasiarlo con pentobarbital.NOTA: En este experimento, los animales fueron eutanasiados después de las mediciones, ya que los cerebros se utilizaron para análisis in vitro en el diseño experimental. Con esta configuración, las mediciones repetidas en estudios longitudinales también son implementables7. Utilice un sistema de tubo completamente nuevo para el siguiente animal. 6. Función de entrada derivada de imagen Abra la herramienta Fusionarlo en PMOD. Cargue la imagen PET como entrada y la TC como referencia. Haga clic en ya coincidente. Abra la herramienta voxel of interest (VOI). Coloque el cursor dentro de la aorta ascendente en el CT. Haga clic en VOI esférico predefinido. Defina un radio de exactamente 0,7 mm. Extraiga la información de actividad de tiempo con el botón estadístico VOI y copie los valores promediados en el portapapeles. 7. Procedimiento de calibración cruzada del sistema de twilite, PET/CT y contador de pozos Calibración Twilite-PET/CTNOTA: El flujo de trabajo presentado para la calibración de la twilite se basa en parte en los procedimientos descritos en el manual de referencia del módulo PSAMPLE de PMOD.Llene una jeringa con aproximadamente 100 MBq de [18F]FDG. Mida la actividad exacta AF con un calibrador de dosis calibrado y documente junto con la fecha y hora de la medición y el volumen de la jeringa completa. El tiempo registrado es el punto de tiempo de referencia para que se realicen todas las correcciones de decaimiento. Llene un vaso de precipitados con 500 ml de agua del grifo. El volumen exacto viene determinado por el método de pesaje. Mida el peso del vaso de precipitados vacío con una escala de precisión apropiada y calibrada (al menos la clase de precisión II). Llene el vaso de precipitados con el agua del grifo y mida el peso mf del vaso de precipitados completo. Calcular el volumen Vb del vaso de precipitados utilizando la diferencia de la masa y la densidad del agua del grifo (r a 0,998 g/ml a 20 oC): Inyectar el [18F]FDG en el vaso de precipitados lleno y rellenar la jeringa vacía a su volumen original con agua del grifo inactiva y medir la actividad AE de la jeringa rellenada en el calibrador de dosis. La concentración de actividad cb de la solución en el vaso de precipitados se da por , que debe ser de aproximadamente 200 kBq/mL. Llene un tubo centrífugo cónico de 50 ml con la solución del vaso de precipitados (evitar grandes burbujas de aire) y colóquelo centralmente en el campo de visión del escáner PET/CT. Llene un catéter idéntico al utilizado en el experimento de imágenes PET/CT y colóquelo en la guía del tubo del sistema twilite. Llene el catéter con la solución del trazador del vaso de precipitados utilizando la bomba peristáltica. Inicie la medición de la curva de actividad de tiempo como se describe en la sección 5, utilizando el mismo parámetro para el tiempo de integración, y rebinning como en el experimento, sin una guía de catéter dentro del cabezal de medición. Este paso garantiza la adquisición de suficientes datos para la corrección en segundo plano adecuada. Después de 2 minutos, sin detener la adquisición de datos del sistema de twilite, coloque la guía del catéter con el tubo lleno en el cabezal de medición y continúe la adquisición de datos durante unos 5 minutos. Inicie una adquisición de PET de 10 minutos del tubo centrífugo cónico de 50 ml en paralelo seguido de una adquisición de TC estándar para la corrección de la atenuación. Reconstruya una imagen PET estática del tubo centrífugo cónico de 50 ml utilizando el mismo algoritmo de reconstrucción de PET y los mismos parámetros descritos en la sección 3. Utilice una herramienta de imágenes de postprocesamiento (por ejemplo, PVIEW) y coloque un VOI cilíndrico que cubra aproximadamente el 70% del volumen dentro de las imágenes PET reconstruidas del tubo centrífugo cónico de 50 ml. Extraiga la concentración media de actividad cPET en kBq/mL dentro del VOI. Vuelva al software del muestreador de sangre y utilice el modo de calibración para corregir el TAC adquirido para la descomposición, la fracción ramificada y el fondo. Añada toda la información necesaria para el nucleido, la concentración de actividad y la hora de inicio de la adquisición de PET. Internamente, el software extrae la tasa de recuento medida con el sistema de twilite (CRtwilite) y calcula el factor de calibración cruzada para el sistema PET y twilite (CFPET/twilite):NOTA: Es importante que el mismo isótopo se utilice tanto para la calibración como para los experimentos PET/CT, ya que la fracción de ramificación varía entre los diferentes isótopos, que se corrige en el proceso de reconstrucción de PET. Este procedimiento debe repetirse regularmente en términos de control de calidad, si se modifican componentes importantes del sistema (por ejemplo, tubos, parámetros de adquisición y reconstrucción) y después de las obras de reparación. Calibración del contador de pozos PET/CT Para calcular el contador de pozos CF del factor de calibración del contador de pozos, utilice la misma solución de actividad que se ha producido en el vaso de precipitados para la calibración del sistema de twilite. Espere aproximadamente 6 horas para permitir la reducción de la actividad específica por descomposición para minimizar los efectos de tiempo muerto del detector de centelleo del contador de pozos. Tapa el vaso de precipitados para evitar la evaporación. Calcular la diferencia horaria exacta en el punto de tiempo de referencia y determinar la concentración de actividad real cb(t+) de la solución del vaso de precipitados corrigiendo la concentración de actividad original. Volúmenes predefinidos de pipeta (muestraen V) que son idénticos al volumen de las muestras de sangre medidas dentro de los experimentos (por ejemplo, 200 l), desde el vaso de precipitados en cinco tubos de bloqueo seguro. Mida la actividad de cada uno de los cinco tubos con el contador del pozo para 180 s.NOTA: Si el coeficiente de variación para una sola medición es superior al 1%, se debe aumentar el tiempo de medición. Registre la tasa de recuento medida en recuentos por minuto [cpm] para cada tubo y la hora de inicio de la medición. Realice una corrección de decaimiento. Calcular el factor de calibración CFpozo-contador para cada medición dividiendo la tasa de recuento corregida de descomposición CRbien-contador del contador de pozos por la concentración de actividad corregida de descomposición del vaso de precipitados cbeaker(t+): Promedio de los cinco factores de calibración para obtener el factor de calibración medio.