小動物陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影における連続的な血液サンプリングにより、動脈入力機能の測定が可能

すべての動物の取り扱いと実験は、メクレンブルク西部ポメラニア州動物研究委員会によって承認されました (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, 承認: 03.04.2018).実験は、ARRIVEガイドラインに従って行われました。 注:動物は、水と食品のアドリビタムと標準的な条件(22±2°C、12時間の昼夜サイクル)の下で保たれた。シャントシステムの準備に必要なすべての機器、操作手順、実際の測定値は、材料の表に記載されています。 1. 動物のカテーテル法の準備と外科的処置 水への自由なアクセスと少なくとも12時間の動物を速く。麻酔の場合は、ラットを誘導室に入れ、酸素/イソファランミックスで連続的に充填します。開始使用の場合は2.5-3.5%のイソファランとメンテナンスのために1.5-3.0%(流量1.2-1.5 L/min)。注: 断食は、トレーサー[18F]FDG を使用するスタディには必要ですが、他のトレーサーには必要ありません。セクション4で説明する手動血液引き出しを使用してグルコース血中濃度を測定することは、安定した値を確保するか、運動モデリングで修正することをお勧めします。 麻酔されたラットを加熱マットの後の位置に置き、外科顕微鏡の下に置き、目に獣医の整分を加える。直腸プローブで実験中にラットの体温を連続的に監視し、維持します(37 ± 0.5 °C)。 ラットの脚を作業面にテープで留め、脚を位置に保持します。粘膜消毒剤で手術部位を消毒し、ラットの脚と股(操作側)を剃ります。消毒剤で最終的なクレンジングで仕上げます。 ラットの鼠径部に外科鉗子とはさみを用いて約20mmの切開を行う。細かい皮膚層を解剖し、大腿静脈、動脈および神経をマイクロ鉗子で露出させる。各大腿静脈と動脈の下に2つの細かいフィラメントを置きます。 各遠位フィラメントで静脈と動脈をシールし、ブルドッグクランプで緊張の下で保持します。近位縫合糸フィラメントを使用して、ブルドッグクランプ(結び目なし)を使用して容器を張合します。 動脈瘤クランプ近位で静脈をブロックしますが、ブルドッグクランプで縫合糸から2〜3mm遠位。角膜はさみを使用して静脈(直径の1/3)に小さな切開を行い、無菌綿スワップで漏出した血液を除去します。鈍い鉗子で静脈を拡張し、それを開いたままにします。シャープなカテーテル(内径[ID]:0.58mm、外径[OD]:0.96mm)を静脈に挿入し、動脈瘤クリップまで近位方向に押し込みます。 動脈瘤クリップを開き、カテーテルを近位方向(約2〜3センチメートル)に押し、カテーテルが右に置かれると、血液がカテーテルに流れ込む。2つの結び目を作ることによって近位縫合でカテーテルを固定する;必要に応じて、静脈とカテーテルの周りに追加の縫合糸を配置します。ヘパリン化生理食液(50単位/mL)の100 μLで満たされたインスリン注射器(30G針)を洗い流し、吸引することによってカテーテルの機能を確認してください。 ステップ 1.6 と 1.7 を繰り返して、動脈にカテーテルを配置します。 両方のカテーテルが正しく置かれたら、縫合糸で足を閉じ、PET/CTに動物を運ぶ。注:動物の輸送中にカテーテルで可能な限り注意してください、そうでなければカテーテルのシフトが発生する可能性があります。 2. シャントシステムのセットアップ 図 2:測定設定のスキーム。(A) 測定設定の概略図。(B) ツイライト検出器、蠕動ポンプ、異なるコネクタタイプを備えた接続シャントシステムの写真。動物(1)がPET/CT(2)でスキャンされている間に、ラットの血液中の放射能の時間経過が検出される。従って動脈(a)および静脈(b)カテーテルはアダプタの部分(コネクタオレンジ、コネクタ青およびコネクターの緑)を介して検出器ポンプシステムに接続される。動脈血液は、検出器(3)を介して動脈カテーテルから蠕動ポンプ(4)に送り込まれ、静脈カテーテルを介して体内に戻される。3ウェイバルブ(7)は、トレーサー注入、手動血液の描画とすすりを行うためにチューブシステムに統合されています。Tピース(8)を組み立てて活性を注入する。検出器は、連続的な血液データを表示、校正、修正するためにコンピュータに接続されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 細かい穴のポリエチレンチューブ(FBPT)の6つの部分を切り取ります(ID:0.58 mm、OD:0.96 mm)c = 735 mmの長さで切り取ります。e = 100ミリメートル;f = 171 mm, g = 875 mm;h = 90 mm およびi = 75 mm (図2)シリコーンポンプチューブ(ブラック/ブラック、ID:0.76mm、OD:2.48mm)の8つの部分を切り取り、長さは約20mmです。 シリコーンポンプ管dの両端に(ID 2.5 mmからID 1.5 mmまで)(イエロー/ブルー/イエロー、ID:1.52 mm、OD:3.20 mm)を配置します。使用するリダクション コネクタのもう一方の端に、シリコーン チューブ (ブラック/ブラック/ブラック) の準備済みの 20 mm 部分を配置します (図 2のコネクタ青を参照)。 FBPT の準備済み部分cを、シリコン ポンプ チューブdの一端に青色(イエロー/ブルー/イエロー)、および組み立てコネクタコネクタの準備済み部分e を青で組み立てます。他の端。2つのTピース5と6の両端にシリコーンチューブ(黒/黒/黒)の準備された20mm部分を置きます(チューブTコネクタID:1.5mm、図2のコネクタグリーンを参照)。 FBPTの部分eの自由端を組み立てられたコネクターの左側に緑色(5)接続し、FBPTの準備された部分fをコネクタグリーン(5)の反対側に置きます。 組み立てられたコネクタの左側にFBPTの部分fの自由端を緑(6)に置き、FBPTの準備済み部分gをコネクタグリーン(6)の反対側に置きます。 組み立てられたコネクタの自由端にFBPTの準備された部分hを、組み立てられたコネクタの緑(5)とFBPTの準備された部分iを、組み立てられたコネクタの自由な端に緑(6)に加えます。 コンビストッパーを皮下針(G 23 x 1 1/4’/ø 0.60 mm x 30 mm)に接続し、3ウェイバルブに追加します。FBPTの部分hの自由な端に針が付いている準備された三方弁を置く。皮下注射針にコンビストッパーを接続し、FBPTの部分iの自由な端に針を置きます。注: オンライン採血を開始する前に、セクション 5 を参照してください。 FBPTの部分cおよびgの自由な端をヘパリン化生理食液(50単位/mL)の20 mLで満たされた100 mLビーカーに入れる。シャントシステムが生理生理生理生理液で完全に満たされるように、流量1.52 mL/minの蠕動ポンプを開始します。その後、部分cとgの端部とFBPTの部分iの中央に3つのはさみクランプをセットしました。 FBPT のパーツcおよびgからはさみクランプを取り出します。動脈カテーテルaをFBPTの部分cの自由端に接続し、静脈カテーテルbをFBPTの部分gの自由端に接続する(図2のコネクタオレンジを参照)。 3. 画像の取得と再構築 シャトルベッドパレット(70mm)の頭の位置に動物を置きます。ラットの呼吸を制御し、画像取得を通じて加熱パッドと直腸プローブを使用して体温を37±0.5 °Cに保ちます。シャトルベッドを注射用の拡張ベッド位置(取得前)に移動し、挿入されたカテーテルをシャントシステムに接続します。 イソファルラン(酸素中のイソファルラン2.5%、流量1.2-1.5 L/min)を鼻コーンを介して麻酔下に置きます。 1.52 mL/minの流量で蠕動ポンプを起動し、シャントシステムを動物の血液で満たします。シャトルベッドをPET検出リングの視野の中央に移動し、オンライン採血システムを開始します(セクション5を参照)。 60 sの後にセクション3.5に記載のパラメータを使用してPET/CTワークフローを開始し、その後、Tピースを介して約0.5±0.1mLの体積で約22 MBq[18F]FDGの用量を注入します。その後、約150μLのヘパリン化生理理液でTピースを洗い流します。 60分以上のダイナミックPETとPETイメージングの最後にCTスキャンを取得します。 PET放出取得の場合は、時間オプションで取得に3600 s(60分)を設定します。研究同位板として F-18 を選択し、エネルギー レベルとして 350-650 keV を使用し、タイミング ウィンドウとして 3,438 ns を使用します。 CT 取得の場合は、取得オプションで減衰スキャンを選択します。[投影設定] フィールドで、半分の合計回転に対して 120投影を選択します。視野(FOV)と解像度の設定では、275 mm軸スキャン長のバインディングとして低倍率と4 x 4を選択し、3328 pxを経軸CCDサイズとして選択します。露光設定フィールドでは、電流の場合は500 μA、電圧では80kV、露光時間は180ミリ秒に設定します。 PET発光ヒストグラムの場合は、ダイナミックフレーミングとして20フレーム(6 x 10秒、8 x 30秒、5 x 300秒、1 x 1800秒)を設定します。遅延として減算を選択します。高度な設定フィールド 128 をsinogram幅として選択し、3をスパンとして、リング差とデッドタイム補正として 79 を選択します。 PET の再構成では、2 次元順序付きサブセット期待値の最大化 (2D-OSEM) を使用して、散布シノグラム、4反復、フーリエを再構成アルゴリズムとして再ビニングします。マトリックスサイズとして128 x 128を選択し、1をイメージズームとして使用し、すべてフレームとして、すべてのセグメントとして使用します。 4. 手動採血の手順 撮像集録を開始した後、手動採血を30s、60s、90s、600sおよび1800sに行う。注:特にトレーサー注射後の最初の1分以内に手動血液の採取数を増やすことを強くお勧めします。したがって、血液サンプル体積は、サンプル6当たり20〜30μLに減少する必要があります。 最初の3ウェイバルブを開き、トレーサー注射後に毛細血管採血EDTAチューブ30sに100μLの動脈血液を集めます。他の時点についても同じ手順を繰り返します。空のチューブと血液充填チューブの重量を決定します。 ウェルカウンターで180sの全血の活動(カウント/時間単位)を測定し、後でkBq/mLでデータを得るためにクロスキャリブレーションされます。ウェルカウンタ測定の開始時刻を記録します。kBq/mLで手動血液サンプリングの各時間ポイントの全血の活動を計算し、減衰補正を適用し、時間活動曲線でデータを転送します。 5. オンライン採血の手順 チューブガイドを使用してチューブを検出器に入れます。血液サンプラーソフトウェア(例えば、PSAMPLE)を起動し、集録インターフェースを開きます。オンラインの血液サンプリングセットアップとPET/CTのコンピュータが時刻同期であることを確認します。 トレーサーを注入する前に、スタートボタンを正確に60度押して、背景補正に十分なデータを取得します。測定後、PMODデータベースの保存ボタンを介して生データを保存します。 オンライン血液データの補正と校正については、補正インターフェースに切り替えます。減衰補正を有効にし、18 F. 画像取得の開始時刻を定義し、平均ボタンで背景補正を実行できるようにします。前に決定したキャリブレーション係数でキャリブレーションとタイプを有効にします(セクション7.1を参照)。 保存TACボタンを使用して修正および校正された血液データを保存し、ファイルblood.crvを選択します。このファイルは、運動モデリングツールに全血入力曲線としてロードすることができ、運動モデリングを実行することができます。余分な肉体シャントシステムからカテーテルを切り離します。 PET/CTスキャナから動物を切り離し、ペントバルビタールで安楽死させる。注:この実験では、実験設計におけるインビトロ分析に脳を用いたため、測定後に動物を安楽死させた。この設定では、縦方向の研究で繰り返し測定も実装可能7.次の動物のための完全に新しいチューブシステムを使用してください。 6. 画像派生入力機能 PMODでヒューズツールを開きます。PET イメージを入力として読み込み、CT を参照として読み込みます。既に一致しているクリックします。 対象のボクセル (VOI) ツールを開きます。CT の昇順大上部内にカーソルを置きます。正確に 0.7 mm の半径を定義する VOI 統計ボタンで時間活動情報を抽出し、平均値をクリップボードにコピーします。 7.ツイライトシステム、PET/CTおよびウェルカウンターのクロスキャリブレーションの手順 ツイライトペット/CTキャリブレーション注:ツイライトのキャリブレーションのための提示されたワークフローは、PMODのPSAMPLEモジュールのリファレンスマニュアルに記載されている手順に部分的に基づいています。[18F]FDGの約100 MBqで注射器を充填します。キャリブレーションされた用量キャリブレータで正確な活動A Fを測定し、測定の日時と完全なシリンジの体積と一緒にそれを文書化します。記録された時間は、すべての減衰補正を実行するための基準時間ポイントです。 500 mLの水道水でビーカーを満たします。正確な容積は計量方法によって決定される。適切で校正された精密スケール(少なくとも精度クラスII)で空のビーカーの重量m eを測定します。ビーカーを水道水で満たし、フルビーカーの重量mfを測定します。 質量と水道水の密度の差を使用してビーカーの体積Vbを計算します(r = 0.998 g/mL、20°C) 充填ビーカーに[18 F]FDGを注入し、空のシリンジを不活性な水道水で元の体積に補充し、用量キャリブレーター内の補充シリンジの活性AEを測定する。ビーカー中の溶液の活性濃度cbは、約200kBq/mLであるべきである。 ビーカーからの溶液で50 mLの円錐遠心管を充填し(大きな気泡を避ける)、PET/CTスキャナの視野に中央に配置します。PET/CTイメージング実験で使用されるタイプと同じカテーテルを充填し、ツイライトシステムのチューブガイドに入れます。蠕動ポンプを使用してビーカーからトレーサー溶液でカテーテルを充填します。 セクション5で説明するように時間活動曲線の測定を開始し、積分時間に同じパラメータを用いて、実験と同様に再ビニングし、測定ヘッド内のカテーテルガイドを含まない。この手順により、適切な背景補正に十分なデータを取得できます。2分後、ツイライトシステムのデータ取得を停止することなく、充填チューブでカテーテルガイドを測定ヘッドに入れ、約5分間データ集録を継続する。 50 mL円錐遠心分離管の10分PET取得を並行して開始し、その後減衰補正のための標準的なCT取得を開始する。セクション3で説明する同じPET再構成アルゴリズムとパラメータを使用して、50 mL円錐遠心管の静的PET画像を再構築します。後処理イメージングツール(例えば、PVIEW)を使用し、50 mL円錐遠心管の再構成されたPET画像の内部に体積の約70%をカバーする円筒形VOIを配置します。VOI内のkBq/mLで平均活性濃度c PETを抽出する。 血液サンプラーソフトウェアに戻り、キャリブレーションモードを使用して、取得したTACの減衰、分岐分数、背景を修正します。核種、活性濃度、PET取得開始時刻に必要なすべての情報を追加します。内部的には、ソフトウェアはツイライトシステム(CRツイライト)で測定されたカウントレートを抽出し、PETおよびツイライトシステム(CFPET/ツイライト)のクロスキャリブレーション係数を計算します。注:分岐分率は、PET再構成プロセスで補正される異なる同位体間で異なるため、キャリブレーションとPET/CT実験の両方に同じ同位体を使用することが重要です。この手順は、システムの重要なコンポーネント(例えば、チューブ、取得および再構成パラメータ)を変更した場合、および修理作業後、品質管理の面で定期的に繰り返す必要があります。 PET/CTウェルカウンターキャリブレーション ウェルカウンタのキャリブレーション係数CFウェルカウンターを計算するには、ツイライトシステムの較正のためにビーカーで生成されたのと同じ活性溶液を使用します。ウェルカウンターのシンチレーション検出器のデッドタイム効果を最小限に抑えるために、減衰による特定の活性の低減を可能にするために約6時間待ちます。蒸発を避けるためにビーカーをふたします。 基準点までの正確な時差を算出し、元の活性濃度を補正してビーカーの溶液の実際の活性濃度c(t+)を決定する。実験内で測定された血液サンプルの体積(例えば、200 μL)と同一のピペット定義体積(Vサンプル)を、ビーカーから5つのセーフロックチューブにします。180sの井戸カウンターで5つの管のそれぞれの活動を測定する。注: 単一の測定の変動係数が 1% を超える場合は、測定時間を増やす必要があります。各チューブの1分あたりのカウント数[cpm]と測定開始時間の測定カウント率を記録します。減衰補正を実行します。 ビーカーの減衰補正活性濃度でウェルカウンターの減衰補正カウント率CRウェルカウンターを割って各測定のキャリブレーション係数CFウェルカウンターを算出cビーカー(t+): 平均キャリブレーション係数を得るために5つのキャリブレーション係数を平均します。