Il campionamento continuo del sangue nella tomografia a emissione di positroni di piccole dimensioni/tomografia computerizzata consente la misurazione della funzione di input arteriosa
Özet
Qui viene descritto un protocollo per il campionamento continuo del sangue durante l’imaging PET/T dei ratti per misurare la funzione di input arterioso (AIF). Vengono dimostrati la cateterizzazione, la calibrazione e l’impostazione del sistema e l’analisi dei dati della radioattività sanguigna. I dati generati forniscono parametri di input per la successiva modellazione bio-cinetica.
Abstract
Per l’analisi quantitativa e la modellazione biocinetica della tomografia a emissione di positroni/dati di tomografia computerizzata (PET/CT), la determinazione della concentrazione temporale temporale temporale temporale temporale-attività nota anche come funzione di input arterioso (AIF) è un punto chiave, in particolare per la caratterizzazione dei modelli di malattie animali e l’introduzione di radiotracciatori di recente sviluppo. La conoscenza della disponibilità di radiotracer nel sangue aiuta a interpretare i dati PET/CT-derivati dell’attività tissutale. A tale scopo, si consiglia di misurare l’AIF durante l’imaging PET/T. A differenza del campionamento manuale del sangue e degli approcci derivati dall’immagine, il campionamento continuo del sangue online presenta diversi vantaggi. Oltre alla perdita di sangue ridotta al minimo, c’è una risoluzione migliorata e una precisione superiore per la misurazione dell’attività sanguigna. Tuttavia, il principale inconveniente del prelievo di sangue online è la preparazione costosa e dispendiosa in termini di tempo per cateterizzare i vasi femorali dell’animale. Qui, descriviamo un flusso di lavoro facile e completo per la cateterizzazione e il campionamento continuo del sangue durante la piccola imaging PET/CT animale e lo confrontamo con il campionamento manuale del sangue e un approccio derivato dall’immagine. Utilizzando questo flusso di lavoro altamente standardizzato, viene dimostrata ladeterminazione dell’AIF fluorodeossiassia ([18 F]FDG). Inoltre, questa procedura può essere applicata a qualsiasi radiotracciatore in combinazione con diversi modelli animali per creare una conoscenza fondamentale delle caratteristiche cinetica e del modello tracciante. Ciò consente una valutazione più precisa del comportamento dei prodotti farmaceutici, sia per gli approcci diagnostici che terapeutici nella ricerca preclinica delle malattie oncologiche, neurodegenerative e miocardiche.
Introduction
La tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata (PET/CT) è una tecnologia di imaging nucleare che consente la visualizzazione dei processi metabolici nel corpo in seguito all’iniezione di un ligando etichettato radioattivamente, chiamato anche tracciante. Mentre il ligando è una molecola che è coinvolta in una via metabolica o si rivolge alle proteine della superficie cellulare, l’etichetta radioattiva è un radionuclide che emette positrone. I raggi gamma sono emessi indirettamente dal decadimento del positrone e consentono di rilevare la sua distribuzione nell’organismo con rivelatori PET extracorporei. In questo modo, diverse molecole cellulari possono essere mirate: recettori e trasportatori di neurotrasmettitori, processi metabolici come glicolisi o proteine mitocondriali come la proteina traslocatore 18 kDa (TSPO) per rilevare le cellule glia attivate.
Nella ricerca preclinica, il PET/TC è un metodo interessante per studiare i processi biochimici in modo non invasivo in vivo, consentendo così studi longitudinali. I dati PET/CT supportano l’analisi dei meccanismi della malattia, la valutazione delle caratteristiche e della farmacocinetica dei nuovi farmaci e la convalida di entrambi i radiotracciatori attuali e nuovi per la ricerca traslazionale.
Durante le analisi PET/T È possibile definire tre stati di tracciante (esempio del modello di compartimento a 2 tessuti): in primo luogo, il tracciante scorre all’interno del sangue dopo la sua applicazione (stato 1; conc.[sangue]). In secondo luogo, entra nel tessuto attraverso il letto capillare e può esserci liberamente muoversi all’interno dello spazio extracellulare o è inspecifico legato a diverse strutture cellulari o extracellulari (stato 2; conc.[non spec]). In terzo luogo, il tracciante può essere specificamente legato (con o senza intrappolamento metabolico) alla sua molecola bersaglio (stato 3, conc.[spec]). Tutti questi processi dinamici tra i compartimenti sono in una certa misura bidirezionali e i processi di diffusione sono descritti da costanti di frequenza (K1, k2, k3 e k4). Mentre la concentrazione del tracciante nel sangue (cioè lo stato 1) è chiamata “Input”, la concentrazione di tracciante inspecifico e specificamente legato (cioè stato 2 e stato 3) è chiamata “Output” e può essere derivata direttamente dall’immagine PET. Questa relazione fisiologica può essere visualizzata nel modello di compartimento a 2 tessuti (Figura 1).
Figura 1 : Il modello compartimentale a due tessuti. Vengono visualizzate le condizioni fisiologiche dei tre diversi stati di tracciante e i processi dinamici tra di essi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nel caso ideale, il conc.[spec] è proporzionale alla concentrazione della sua molecola bersaglio. Tuttavia, l’output della misura PET/CT è la somma di conc.[spec] e conc.[unspec]. Per determinare la conc.[spec] nella regione di interesse, in parallelo viene determinato il conc. Utilizzando equazioni matematiche appropriate è ora possibile calcolare il conc. Tuttavia, in molti casi, tale regione di riferimento priva della proteina bersaglio non è disponibile1,2. In questi casi, il conc.[sangue] puòessere utilizzato per determinare il conc. Dal momento che il conc.[sangue] varia a causa di diversa distanza del fegato e dei reni, escrezione, flusso sanguigno, diversa penetrazione della barriera rom-sangue cerebrale e fattori correlati alla malattia3, l’attuale gold standard è quello di misurare il conc. sangue in parallelo alla scansione PET/TC mediante campionamento continuo del sangue. Questo dà la funzione di input arterioso (AIF), che è definita come conc.[sangue] nel tempo4. Da notare che l’esecuzione di un campionamento continuo del sangue è considerato tecnicamente altamente impegnativo, soprattutto in piccoli animali come ratti o topi5.
Qui, forniamo un protocollo facile e pratico per campionare continuamente il sangue dai ratti attraverso uno shunt arteriovenoso (a-v) tra la vena femorale e l’arteria. Accoppiati a un sistema di rivelatore-pompa disponibile in commercio, siamo in grado di generare un AIF continuo in tempo reale durante la scansione dinamica [18F]fluorodeoxyglucose ([18 F]FDG)-PET/CT nei ratti e confrontarla con approcci alternativi. L’imaging PET/CT è stato eseguito in ratti sprague dawley maschi all’età di 4 mesi, con un peso medio di 462 g e 33 g (media deviazione standard) utilizzando uno scanner PET/CT multimodalità.
Poiché durante la serie di misurazioni viene utilizzata un’ampia gamma di dispositivi (calibratore di dose, campionatore di sangue online, PET/CT e contatore dei pozzi), è necessaria una procedura di controllo della qualità denominata taratura incrociata per verificare l’accuratezza quantitativa di tutti i sistemi e per compensare le differenze. La calibrazione incrociata nel contesto del campionamento del sangue online significa che il tasso di conteggio per una determinata concentrazione di attività misurata in immagini PET corrette può essere convertito nella concentrazione misurata con il sistema di twilite per la stessa concentrazione. Pertanto, è stata stabilita una procedura di calibrazione incrociata tra PET/TC, sistema di campionamento del sangue e contatore del pozzo.
Questa metodologia altamente standardizzata fornisce un potente approccio per quantificare i processi metabolici e cellulari nella ricerca preclinica su piccoli animali ed è un modo elegante per migliorare l’affidabilità e la riproducibilità dell’AIF. L’AIF può quindi essere utilizzato per quantificare il tracciante specificamente associato nel tessuto nei dati preclinici PET/TC utilizzando la modellazione bio-cinetica.
Protocol
Representative Results
Discussion
I risultati presentati sono estratti da un progetto su larga scala sull’attività neuronale in un modello animale transgenico della malattia di Huntington rispetto ai ratti di tipo selvatico. Complessivamente sono stati cateterizzati 30 ratti transgenici e selvatici ed è stato eseguito il campionamento del sangue manuale e online in parallelo a[18F]FDG-PET/CT. Tre AIF di ratti wildtype sono mostrati qui per dimostrare la gamma dei possibili esiti del protocollo. I risultati del progetto completo sui cambiamenti dell’attività neuronale in un modello animale della malattia di Huntington saranno pubblicati altrove.
Il metodo qui descritto consente un campionamento continuo del sangue rapido e preciso in una grande coorte e fornisce un AIF senza spazi per la modellazione cinetica dei dati PET/CT dinamici nei piccoli animali. Viene generata una circolazione sanguigna esterna per rilevare l’effettiva attività temporale nel sangue degli animali; di conseguenza si evita una perdita di sangue. La procedura chirurgica si basa su Jespersen et al.8 ed è stata modificata per soddisfare le esigenze di campionamento del sangue arterioso durante le misurazioni PET/TC. Il sistema di shunt è stato convalidato da Weber etal. Con la configurazione qui usato usato, un volume di sangue esterno di circa 1,1 mL è in esecuzione attraverso il sistema di rilevatore-pompa. Un ratto di 4 mesi ha un volume sanguigno totale di circa 30 mL. Il diametro della vena femorale e dell’arteria è di circa 0,45-0,6 mm10 e deve essere un po ‘inamidata per inserire il catetere utilizzato.
L’AIF può anche essere misurato attraverso sporadica raccolta manuale del sangue o essere ricostruito dai primi tempi delle immagini PET stesse (derivata dall’immagine). Entrambi gli approcci sono stati eseguiti con i dati qui presentati e confrontati con il campionamento continuo del sangue.
Rispetto al campionamento manuale del sangue, con il campionamento del sangue online una risoluzione temporale notevole (qui: 1800 punti dati per 30 min) diventa possibile. Le estrazioni manuali di sangue (qui: 5 punti dati per 30 min) sono limitate al volume sanguigno presente nel piccolo animale, in quanto questi campioni non vengono pompati nella circolazione dell’animale. Inoltre, un intervallo massimo di 10-15 s è tecnicamente attuabile e le informazioni importanti per la modellazione cinetica sono mancate. Questo può essere visto anche nei dati presentati, come una differenza nel numero massimo rilevato di campionamento continuo e manuale del sangue è evidente (Figura 3A,C,E). Con il campionamento del sangue online il picco rilevato era superiore rispetto alla funzione di input derivata dall’immagine dell’aorta ascendente11 (Figura 3B,D,F). La funzione di input derivata da Imaged è limitata alla risoluzione spaziale degli scanner PET, che si traduce in effetti di volume parziali12 ed è influenzata dagli intervalli di tempo ricostruiti.
Un vantaggio generale di questa procedura di campionamento continuo del sangue è che il tracciante può essere applicato tramite il catetere, che è meno incline al disturbo rispetto all’iniezione attraverso la vena posteriore della coda laterale. Tenete a mente che il tracciante deve essere applicato in un volume moderato per evitare che il tracciante rimanga all’inizio del sistema di tubi. Per garantire che nessuna attività rimanga nel volume morto del pezzo a T, viene lavato con soluzione salina eparinizzata in seguito. Inoltre, si consiglia l’utilizzo di una pompa di infusione in quanto consente la regolazione della velocità dell’iniezione del tracciante e può contribuire ad un’acquisizione più coordinata del picco massimo di radioattività con campionamento manuale del sangue13.
Esistono alcune possibili difficoltà che potrebbero verificarsi durante l’elaborazione del protocollo e possono essere gestite dalla risoluzione dei problemi seguente. Una posizione non ottimale dei cateteri potrebbe portare ad un’esecuzione incompleta del protocollo, quindi assicurarsi che siano fissati accuratamente con la sutura prossimale e che il catetere sia spinto 2-3 cm propimali nel recipiente. Inoltre, è possibile utilizzare l’adesivo di fibrina. Anche la formazione di trombi può ostigare i cateteri. Questo può essere gestito aumentando la concentrazione di eparina e il successivo lavaggio dei cateteri o del sistema di tubi. Tale risultato non ottimale a causa di intasamento dei cateteri è mostrato nei risultati, il picco massimo è mancato (Figura 3E). Un altro punto critico per quanto riguarda la protezione e il benessere degli animali è la lunghezza del flusso sanguigno extracorporeo. Si consiglia quindi di ridurre al minimo la lunghezza del sistema di tubi.
Quando viene eseguito il campionamento del sangue, è necessario prendere in considerazione tre correzioni dell’AIF risultante. In primo luogo, la correzione del plasma. I traccianti equilibrati tra plasma e cellule del sangue, principalmente eritrociti. A seconda della velocità di questi processi di diffusione, il tracciante disponibile è presente principalmente nel plasma. Per alcuni traccianti, il rapporto tra plasma e sangue intero deve essere considerato, come quelli più lipofilici. In questi casi, l’attività plasmatica deve essere determinata. Se si usa [18F]FDG, non è necessario centrifugiare il sangue per determinare l’attività plasmatica, in quanto esegue un elibrismo molto rapido tra plasma e globuli rossi e la disponibilità di [18F]FDG nel plasma è simile a quella dell’intero sangue. In secondo luogo, la correzione dei metaboliti. Molti traccianti sono metabolizzati nel sangue intero e alcuni di questi metaboliti sono ancora etichettati radioattivamente14. Questa frazione è presente nell’AIF, ma non è disponibile per l’assorbimento dei tessuti. Per alcuni traccianti i metaboliti devono essere determinati nel sangue intero o nel plasma e l’AIF deve essere corretto. In terzo luogo, la correzione della dispersione. La dispersione è causata da diversi fattori, tra cui (a) la differenza di tempo sistematica tra i tempi di arrivo del tracciante nel tessuto rispetto al sito di campionamento periferico (correzione del ritardo) e (b) e la sbisciazione della forma dell’AIF, in quanto il trasporto tracciante all’interno del sistema di tubi èinfluenzato dalla sua cinetica di ritardo di primo ordine (PT 1). Sono state proposte diverse correzioni basate sulla deconvoluzione, basate principalmente sul modello di Iida et al.15, ma la maggior parte di esse sono soggette al rumore. Un metodo di correzione che elude la deconvoluzione ed è quindi meno soggetto al rumore è stato proposto da Munk et al.16. Le misurazioni necessarie per stimare i parametri di correzione devono essere eseguite per ogni combinazione di tubi e traccianti utilizzati. La correzione della dispersione deve essere eseguita prima della correzione del ritardo di tempo17. Tuttavia, principalmente i processi di perfusione dei tessuti veloci sono influenzati dalla dispersione ed è stato anche dimostrato che per la modellazione di [18F]FDG studi una correzione di dispersione non è assolutamente necessario18. Pertanto, negli esempi presentati la correzione della dispersione dell’AIF non è stata applicata.
Una corretta calibrazione del calibratore della dose in loco e il suo regolare controllo di qualità sono un prerequisito per il tipo di procedure di calibrazione incrociata qui presentate. Tuttavia, se l’attività somministrata all’animale viene misurata con lo stesso calibratore della dose, qualsiasi deviazione di precisione verrà annullata, a condizione che la deviazione sia costante e che sia stata seguita la procedura completa di calibrazione incrociata, correzioni specifiche del nuclide (ad esempio, per emivita variabile o rapporto di ramificazione diverso). Utilizzando una tale procedura di calibrazione per armonizzare i sistemi PET/CT utilizzati nell’assistenza e nella ricerca sulla salute umana, si potrebbe ottenere una precisione di almeno il 5-10%19,20.
Gli AIF calibrati e corretti generati dalla corretta attuazione di questo protocollo consentono la quantificazione dei dati PET/CT per la caratterizzazione dei modelli di malattie animali, la sperimentazione di nuove opzioni terapeutiche, la creazione di nuovi traccianti e il trasferimento di traccianti esistenti in un’altra specie. Apparentemente, il campionamento continuo del sangue in [18]FDG-PET/CT nei ratti fornisce le informazioni più affidabili per il calcolo dell’input nella modellazione bio-cinetica. Tenendo conto del metabolismo individuale, in particolare lo sgombero del fegato, è possibile una valutazione più precisa degli effetti patologici o terapeutici rilevanti. Con questo protocollo praticabile, una maggiore efficienza dell’analisi preclinica dei dati PET/CT è facilmente attuabile.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine Susann Lehmann, Iloana Klamfue e Petra Wolff per l’edilizia e la cura degli animali e Matthias Wyss per il supporto durante la creazione del sistema di campionamento del sangue online. Il piccolo animale PET/CT è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Materials
| Sugery for arteriovenous shunt | |||
| anesthesia station | Groppler | ||
| aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
| bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
| dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
| heating mat | |||
| insulin syringe | Braun | 30G | |
| needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
| pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
| portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
| surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
| suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
| suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
| two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
| vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
| PET/CT imaging | |||
| dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
| Inveon PET/CT | Siemens | ||
| tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
| manuel bloodsampling | |||
| capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
| test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
| well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
| automatic blood sampling | |||
| BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
| bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
| combi stopper | Braun | 4495101 | |
| heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
| hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
| microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
| PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
| reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
| silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
| silicone pump tubes – adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
| t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |
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