Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation

La maladie de Parkinson (MP) est un trouble neurodégénératif commun, causé par la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) à la substantia nigra pars compacta (SNpc) dans le mésencéphalon ventral (VM), avec une prévalence de plus de 1% dans la population de plus de 60 ans ¹ Fois ^{, 2}. Au cours de la dernière décennie, la thérapie cellulaire, visant à remplacer les cellules dégénératives ou endommagées, ou à nourrir le microenvironnement autour des neurones en dégénérescence, a montré un potentiel dans le traitement de la³. Pendant ce temps, la technologie de reprogrammation a fait des progrès significatifs⁴, qui fournit une source cellulaire prometteuse pour la thérapie de remplacement. Il a été prouvé que les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) et les cellules souches embryonnaires (ESC) sont capables de se différencier en cellules neurales DA, qui pourraient survivre, maturate et améliorer les fonctions motrices lorsqu’elles sont greffées dans des modèles de MP de primates non humains^{5 ,6,7,8}. iPSCs représentent une étape importante dans les technologies de reprogrammation cellulaire et ont un grand potentiel dans la transplantation cellulaire; cependant, il y a toujours une préoccupation au sujet du risque de formation de tumeur des cellules incomplètement différenciées. Une autre source cellulaire pour la transplantation cellulaire est les cellules souches adultes établies par lignée obtenues par reprogrammation directe, telles que les cellules souches neurales induites (iNSC), qui peuvent être dérivées des intermédiaires instables, en contournant la pluripotence étape^9,10,11.

Les iPSC et les iNSC peuvent être reprogrammés à partir de sources cellulaires autologues, telles que les fibroblastes, les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMNC) et divers autres types de cellules^12,13,14, réduisant ainsi le immunogénicité des cellules transplantées dans une large mesure. En outre, par rapport aux iPSC, les iNSC sont inhérents à un risque réduit de formation tumorale et de plasticité liée à la lignée, seulement capable de se différencier en neurones et en gliales¹¹. Dans les études initiales, les iPSC humains ou de souris et les iNSC ont été générés à partir de fibroblastes obtenus à partir de biopsies de la peau, qui est une procédure invasive^14,15. À cet égard, les PBMNC sont une source attrayante de cellules de démarrage en raison du processus d’échantillonnage moins invasif, et de la facilité d’obtenir un grand nombre de cellules dans un court laps de temps d’expansion¹⁶. Les premières études de reprogrammation ont utilisé des systèmes d’administration intégratif, tels que des vecteurs lentiviraux ou rétroviraux, qui sont efficaces et faciles à mettre en œuvre dans de nombreux types de cellules^17; cependant, ces systèmes d’administration peuvent causer des mutations et la réactivation des transgènes résiduels, qui présentent des problèmes de sécurité à des fins thérapeutiques cliniques¹². Le virus Sendai (SeV) est un virus à ARN non intégratif dont le génome à un seul brin à sens négatif ne s’intègre pas dans le génome de l’hôte, mais qui ne se reproduit que dans le cytoplasme des cellules infectées, offrant un véhicule efficace et sûr pour la reprogrammation^{18 ,19}. Des vecteurs SeV recombinants sont disponibles qui contiennent des facteurs de reprogrammation, y compris l’humain OCT3/4, SOX2, KLF4 et c-MYC dans leurs cadres de lecture ouverts. En outre, les vecteurs viraux SeV peuvent être encore améliorés en introduisant des mutations sensibles à la température, de sorte qu’ils pourraient être rapidement enlevés lorsque la température de la culture est élevée à 39 oC²⁰. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour reprogrammer PBMNCs aux iNSCs utilisant le système de SeV.

De nombreuses études ont rapporté la dérivation des neurones DA à partir d’ESC sais humains ou iPSCs en utilisant diverses méthodes^6,8,21. Cependant, il ya une pénurie de protocoles décrivant la différenciation des neurones DA des iNSCs dans les détails. Dans ce protocole, nous décrirarons la génération efficace de neurones DA à partir d’iNSCs en utilisant une méthode en deux étapes. Les précurseurs neuronaux DA peuvent être transplantés dans le striatum des modèles de souris pour des évaluations de l’innocuité et de l’efficacité. Cet article présentera un protocole détaillé qui couvre diverses étapes de la génération de cellules souches neurales induites par le virus Sendai, la différenciation des iNSCs dans les neurones DA, l’établissement de modèles de de souris, à la transplantation des précurseurs de DA dans le striatum des modèles. En utilisant ce protocole, on peut générer des iNSC à partir de patients et de donneurs sains et dériver des neurones DA qui sont sûrs, standardisables, évolutifs et homogènes à des fins de transplantation cellulaire, ou pour la modélisation de la DP dans un plat et l’étude des mécanismes l’évolution et le développement de la maladie sous-jacente.