Transplantation sous-capsulaire rénale du thym embryonnaire Murine traité à la déoxyguanosine de 2'-Deoxyguanosine chez les souris nues
Özet
Nous fournissons une méthode simple et efficace pour transplanter 2′-deoxyguanosine traité E18.5 thymus dans la capsule rénale d’une souris nue. Cette méthode devrait aider dans l’étude de la fonction des cellules épithéliales thymiques et de la maturation des lymphocytes T.
Abstract
Le thymus est un organe immunitaire central important, qui joue un rôle essentiel dans le développement et la différenciation des lymphocytes T. La transplantation de Thymus est une méthode importante pour étudier la fonction épithéliale thymique et la maturation des lymphocytes T in vivo. Ici nous décraurons les méthodes expérimentales utilisées dans notre laboratoire pour transplanter 2′-deoxyguanosine (pour épuiser les lymphocytes du donneur) ont traité le thymume embryonnaire dans la capsule rénale d’une souris nue athymique. Cette méthode est à la fois simple et efficace et ne nécessite pas de compétences ou d’appareils spéciaux. Les résultats obtenus par cette méthode simple ont prouvé que le thymus transplanté peut effectivement soutenir la production de lymphocytes T du destinataire. En outre, plusieurs points clés en ce qui concerne le protocole seront encore élucidés.
Introduction
Le thymus est l’organe immunitaire central, dans les thymocytes subissent une sélection positive et négative, et deviennent des cellules T matures1,2. Une sélection anormale positive ou négative entraîne une immunodéficience ou des pathologies auto-immunes respectivement3,4. Par conséquent, la transplantation d’organe de thymus est une approche importante pour étudier le processus de sélection des lymphocytes T dans le thymus du donneur. Cette méthode est particulièrement cruciale lors de l’analyse de la fonction épithéliale thymique médiée par des mutations génétiques qui causent un phénotype mortel embryonnaire lorsqu’il est muté5.
Afin d’étudier la maturation des lymphocytes T d’un receveur dans le thymus transplanté, l’épuisement des lymphocytes du donneur dans le thymus est nécessaire. À cette fin, embryonnaire de 14, 15 ou 16 jours (E14, E15, E16) thymus est généralement sélectionné6,7. Le thymus des stades plus mûrs peut également être épuisé avec succès des lymphocytes du donneur en traitant avec 2′-deoxyguanosine. Cependant, un protocole détaillé pour épuiser les lymphocytes et l’utilisationde la culture plus ancienne de thymus n’a pas été précédemment décrit 8,9. Tandis que les protocoles de transplantation ont été introduits par plusieurs études10,11, d’autres modifications et améliorations de ces protocoles sont nécessaires.
Notre protocole est séparé en deux parties : (i) L’épuisement des lymphocytes T du stade de développement tardif E18.5 thymus par culture dans les médias contenant 2′-deoxyguanosine. (ii) Transplantation du thymus cultivé en receveurs. Dans cette procédure, nous avons développé un moyen simple de livrer le grand tissu (E18.5 thymus) dans la capsule rénale avec le risque réduit de dommages de rein. Tout en se concentrant sur le thymus stade ultérieur, notre protocole peut également être utilisé directement ou avec des modifications pour la transplantation de thymus à divers stades de développement ou d’autres tissus de taille similaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La transplantation sous-capsulaire rénale du thymus embryonnaire est une méthode importante pour étudier la fonction des cellules épithéliales thymiques et le processus de maturation des lymphocytes T in vivo. Bien qu’il existe plusieurs études expérimentales sur la culture embryonnaire d’organe de thymus et la transplantation6,7, notre protocole fournit une procédure alternative simple sur la culture embryonnaire de thymus murine et sous-capsulaire réna…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme Start de l’Université De Jinan à S.J. et par le Programme des sciences et de la technologie de Guangzhou en Chine (Grant No. 201704020209 à S.J.). Nous remercions Amy Botta (Département de biologie, Université York, Toronto, ON M3J 1P3, Canada) pour la relecture et l’édition du manuscrit.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
Referanslar
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
