Özet

Trasplante subcapsular renal de timo embrionario murino tratado con 2'-desoxiguanosina en ratones desnudos

Published: July 19, 2019
doi:

Özet

Proporcionamos un método simple y eficiente para trasplantar 2′-deoxyguanosine tratado E18.5 timo en la cápsula renal de un ratón desnudo. Este método debe ser un iida en el estudio de la función de células epiteliales timmicas y la maduración de las células T.

Abstract

El timo es un importante órgano inmune central, que desempeña un papel esencial en el desarrollo y diferenciación de los células T. El trasplante de timo es un método importante para investigar la función de las células epiteliales timmicas y la maduración in vivo de las células T. Aquí describiremos los métodos experimentales utilizados dentro de nuestro laboratorio para trasplantar 2′-deoxyguanosina (para agotar los linfocitos del donante) timo embrionario tratado en la cápsula renal de un ratón desnudo atímico. Este método es simple y eficiente y no requiere habilidades o dispositivos especiales. Los resultados obtenidos a través de este sencillo método mostraron que el timo trasplantado puede apoyar eficazmente la producción de células T del receptor. Además, se aclararán varios puntos clave con respecto al protocolo.

Introduction

El timo es el órgano inmune central, dentro del timo timi citocitos se someten a una selección positiva y negativa, y se convierten en células T maduras1,2. La selección positiva o negativa anormal da como resultado inmunodeficiencias o patologías autoinmunes respectivamente3,4. Por lo tanto, el trasplante de órganos de timo es un enfoque importante para estudiar el proceso de selección de células T en el timo del donante. Este método es particularmente crucial cuando se analiza la función epitelial timmica mediada por mutaciones genéticas que causan fenotipo letal embrionario cuando se muta5.

Para estudiar la maduración de las células T de un receptor en el timo trasplantado, es necesario agotar los linfocitos del donante dentro del timo. Para ello, el timo embrionario de 14, 15 o 16 días (E14, E15, E16) se selecciona generalmente6,7. El timo de etapas más maduras también se puede agotar con éxito de los linfocitos del donante mediante el tratamiento con 2′-deoxyguanosina. Sin embargo, un protocolo detallado para agotar linfocitos y el uso del cultivo de timo más antiguo no se ha descrito previamente8,9. Si bien los protocolos de trasplante han sido introducidos por varios estudios10,11, es necesario modificar y mejorar aún más estos protocolos.

Nuestro protocolo se divide en dos partes: (i) Agotamiento de linfocitos T de la etapa de desarrollo tardío E18.5 timo por cultivo en medios que contienen 2′-deoxyguanosine. (ii) Trasplante del timo cultivado en recipientes. En este procedimiento, desarrollamos una manera sencilla de administrar el tejido grande (E18.5 timo) en la cápsula renal con menor probabilidad de lesión renal. Mientras se centra en el timo de etapa posterior, nuestro protocolo también se puede utilizar directamente o con modificaciones para el trasplante de timo en varias etapas del desarrollo u otros tejidos de tamaño similar.

Protocol

El protocolo presentado se adhiere a las directrices del comité de ética de la Universidad de Jinan con respecto al cuidado de los animales. NOTA: Los materiales utilizados se enumeran en la Tabla de materiales. 1. Aislamiento del timo embrionario Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes del experimento, y esterilizar el banco / campana con 70% etanol. Usando dióxido de carbono, anestetiza y eutanas…

Representative Results

Aquí mostramos el timo aislado E18.5 que contiene dos lóbulos completos (Figura1). Además, mostramos la aguja de la vena del cuero cabelludo que fue recortada para formar un bisel en el tubo de perfusión (Figura2). A continuación, también mostramos una imagen representativa de la posición del timo que se trasplantó en la cápsula renal (Figura3A)y el timo después de 8 semanas de crecimiento dentro de los ratones receptores …

Discussion

El trasplante subcapsular renal del timo embrionario es un método importante para estudiar la función de las células epiteliales timmicas y el proceso de maduración de las células T in vivo. Aunque existen varios estudios experimentales sobre cultivo deórganos de timo embrionario y trasplante 6,7, nuestro protocolo proporciona un procedimiento alternativo simple sobre el cultivo del timo embrionario murino y subcapsular renal trasplante para tejido timo má…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Paquete De Inicio de la Universidad Jinan a S.J. y por el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou China (Grant No. 201704020209 a S.J.). Agradecemos a Amy Botta (Departamento de Biología, Universidad de York, Toronto, ON M3J 1P3, Canadá) por la corrección y edición del manuscrito.

Materials

0.5% Povidone iodine Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd 20171113
0.9% Sodium Chloride Injection Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd 2C17112101
1 mL Sterile syringe Solarbio YA1090
2’-Deoxyguanosine MEC HY-17563 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate Corning Incorporated Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish Corning Incorporated 430166
70% ETOH LIRCON 20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies Biolegend 100711 1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1060 To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd 17062111 079 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JC2303 To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1050 To sterilize before use
Flow cytometry BD FACSCanto II
Flunixin meglumine MACLIN F810147 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5 World Precision Instruments 14098 To sterilize before use
Infrared lamp OTLAN MT-810
Needle holder, JZ 14 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J32010 To sterilize before use
PE anti-mouse CD4 Biolegend 100511 1:100
Penicillin-Streptomycin mixture GIBCO 15140122 1:100
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium GIBCO C14-11875-093
Scalp vein needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd XC001
Spring scissors VANNAS S11014-12 To sterilize before use
stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sterile 15cm cotton swab Guangzhou Haozheng 20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P Guangzhou Haozheng 20172640868
Sterile PBS (1x) GENOM GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J41010 To sterilize before use

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2′-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).

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