Özet

Trapianto di subcapsulare renale di 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Topi Nudi

Published: July 19, 2019
doi:

Özet

Forniamo un metodo semplice ed efficiente per trapiantare 2′-deossiguanosina trattata E18.5 tiromusnella capsula renale di un topo nudo. Questo metodo dovrebbe aiutare nello studio sia della funzione epiteliale timica che della maturazione delle cellule T.

Abstract

Il timo è un importante organo immunitario centrale, che svolge un ruolo essenziale nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule T. Il trapianto di timo è un metodo importante per studiare la funzione delle cellule epiteliali timiche e la maturazione delle cellule T in vivo. Qui descriveremo i metodi sperimentali utilizzati all’interno del nostro laboratorio per trapiantare 2′-deossiguanosina (per esaurire i linfociti del donatore) trattati tiromo embrionale nella capsula renale di un topo nudo alatico. Questo metodo è semplice ed efficiente e non richiede abilità o dispositivi speciali. I risultati ottenuti con questo semplice metodo hanno mostrato che il timo trapiantato può sostenere efficacemente la produzione di cellule T del ricevente. Inoltre, diversi punti chiave per quanto riguarda il protocollo saranno ulteriormente chiariti.

Introduction

Il timo è l’organo immunitario centrale, all’interno dei timociti sottoposti a selezione positiva e negativa, e diventano cellule T mature1,2. La selezione positiva o negativa anomala provoca immunodeficienza o patologie autoimmuni rispettivamente3,4. Pertanto, il trapianto di organo timo è un approccio importante per studiare il processo di selezione delle cellule T nel timo del donatore. Questo metodo è particolarmente importante quando si analizza la funzione epiteliale timica mediata da mutazioni genetiche che causano fenotipo letale embrionale quando mutato5.

Per studiare la maturazione delle cellule T di un ricevente nel timo trapiantato, è necessario ridurre i linfociti del donatore all’interno del timo. A questo scopo, il timo embrionale di 14, 15 o 16 giorni (E14, E15, E16) viene solitamente selezionato6,7. Il timo da stadi più maturi può anche essere esaurito con successo dei linfociti del donatore trattando con 2′-deossiaguanosina. Tuttavia, un protocollo dettagliato per esaurire i linfociti e l’uso della vecchia coltura del timo non è stato descritto in precedenza8,9. Mentre i protocolli di trapianto sono stati introdotti da diversi studi10,11, ulteriore modifica e miglioramento di questi protocolli è necessario.

Il nostro protocollo è diviso in due parti: (i) Depletion of T lymphocites from late developmental stage E18.5 thymus by culture in 2′-deoxyguanosine-containing media. ii) Trapianto del timo colto in destinatari. In questa procedura, abbiamo sviluppato un modo semplice per fornire il grande tessuto (E18.5 timo) nella capsula renale con ridotta probabilità di lesioni renali. Mentre ci si concentra sul timo dello stadio successivo, il nostro protocollo può anche essere utilizzato direttamente o con modifiche per il trapianto di timo in varie fasi di sviluppo o altri tessuti di dimensioni simili.

Protocol

Il protocollo presentato aderisce alle linee guida del comitato etico della Jinan University per quanto riguarda la cura degli animali. NOTA: i materiali utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali. 1. Isolamento del timo embrionale Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell’esperimento, e sterilizzare la panca / cappuccio con 70% etanolo. Utilizzando l’anidride carbonica, anestesizzare ed eutan…

Representative Results

Qui mostriamo il timo isolato E18.5 contenente due lobi completi (Figura 1). Inoltre, mostriamo l’ago della vena del cuoio capelluto che è stato ritagliato per formare uno smusso sul tubo di infusione (Figura 2). Successivamente, mostriamo anche un’immagine rappresentativa della posizione del timo che è stato trapiantato nella capsula renale (Figura 3A) e il timo dopo 8 settimane di crescita all’interno dei topi ricitati (<strong …

Discussion

Il trapianto di subcapsulare renale del timo embrionale è un metodo importante per studiare la funzione delle cellule epiteliali timiche e il processo di maturazione delle cellule T in vivo. Anche se ci sono diversi studi sperimentali sulla coltura embrionale dell’organo timo e il trapianto6,7, il nostro protocollo fornisce una semplice procedura alternativa sulla coltura del timo embrionale murino e subcapsulare renale trapianto per timo più vecchio.

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Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal pacchetto iniziale della Jinan University a S.J. e dal programma di scienza e tecnologia di Guangzhou Cina (Grant No. 201704020209 a S.J.). Ringraziamo Amy Botta (Dipartimento di Biologia, Università di York, Toronto, ON M3J 1P3, Canada) per la revisione e la modifica del manoscritto.

Materials

0.5% Povidone iodine Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd 20171113
0.9% Sodium Chloride Injection Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd 2C17112101
1 mL Sterile syringe Solarbio YA1090
2’-Deoxyguanosine MEC HY-17563 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate Corning Incorporated Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish Corning Incorporated 430166
70% ETOH LIRCON 20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies Biolegend 100711 1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1060 To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd 17062111 079 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JC2303 To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1050 To sterilize before use
Flow cytometry BD FACSCanto II
Flunixin meglumine MACLIN F810147 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5 World Precision Instruments 14098 To sterilize before use
Infrared lamp OTLAN MT-810
Needle holder, JZ 14 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J32010 To sterilize before use
PE anti-mouse CD4 Biolegend 100511 1:100
Penicillin-Streptomycin mixture GIBCO 15140122 1:100
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium GIBCO C14-11875-093
Scalp vein needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd XC001
Spring scissors VANNAS S11014-12 To sterilize before use
stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sterile 15cm cotton swab Guangzhou Haozheng 20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P Guangzhou Haozheng 20172640868
Sterile PBS (1x) GENOM GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J41010 To sterilize before use

Referanslar

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  3. Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
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Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2′-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).

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