Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

In der Zellbiologie spielt die Genregulation eine zentrale Rolle. In einem oder mehreren Schritten entlang des Genexpressionswegs haben Gene das Potenzial, reguliert zu werden. Diese Schritte umfassen Transkription (Initiierung, Dehnung und Beendigung) sowie Spleißen, Polyadenylierung oder 3′ Endbildung, RNA-Export, mRNA-Translation und Zerfall/Lokalisierung von primären Transkripten. In diesen Schritten modulieren Nukleinsäure-bindende Proteine die Genregulation. Die Identifizierung von Bindungsstellen für solche Proteine ist ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der Genkontrolle. Mutationsanalyse und phylogenetischer Sequenzvergleich wurden verwendet, um regulatorische Sequenzen oder Proteinbindungsstellen in Nukleinsäuren wie Promotoren, Spleißstellen, Polyadenylierungselementen und Translationssignalen zu entdecken^{1, 2 , 3 , 4}.

Pre-mRNA Spleißen ist ein integraler Schritt während der Genexpression und -regulation. Die Mehrheit der Säugetiergene, auch die beim Menschen, haben Introns. Ein großer Teil dieser Transkripte wird alternativ gespleißt, wodurch mehrere mRNA- und Protein-Isoformen aus demselben Gen oder Primärtranskript erzeugt werden. Diese Isoformen haben zellspezifische und entwicklungsspezifische Rollen in der Zellbiologie. Die 5′ Spleißstelle, der Astpunkt und der Polypyrimidin-Trakt/3′ Spleißstelle sind kritische Spleißsignale, die einer Regulierung unterliegen. Bei negativer Regulierung wird eine ansonsten starke Spleißstelle verdrängt, während bei positiver Regulierung eine ansonsten schwache Spleißstelle aktiviert wird. Eine Kombination dieser Ereignisse erzeugt eine Fülle von funktionell unterschiedlichen Isoformen. RNA-bindende Proteine spielen bei diesen alternativen Spleißereignissen eine Schlüsselrolle.

Es sind zahlreiche Proteine bekannt, deren Bindungsstellen oder RNA-Targets noch identifiziert werden müssen^5,6. Die Verknüpfung von regulatorischen Proteinen mit ihren nachgelagerten biologischen Zielen oder Sequenzen ist oft ein komplexer Prozess. Für solche Proteine ist die Identifizierung ihrer Ziel-RNA oder Bindungsstelle ein wichtiger Schritt bei der Definition ihrer biologischen Funktionen. Sobald eine Bindungsstelle identifiziert ist, kann sie durch molekulare und biochemische Standardanalysen weiter charakterisiert werden.

Der hier beschriebene Ansatz hat zwei Vorteile. Erstens kann es eine bisher unbekannte Bindungsstelle für ein Protein von Interesse identifizieren. Zweitens besteht ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes darin, dass er gleichzeitig eine Sättigungsmutagenese ermöglicht, die ansonsten arbeitsintensiv wäre, um vergleichbare Informationen über Sequenzanforderungen innerhalb der Bindungsstelle zu erhalten. Somit bietet es ein schnelleres, einfacheres und kostengünstigeres Werkzeug, um Proteinbindungsstellen in der RNA zu identifizieren. Ursprünglich wurde dieser Ansatz (SELEX oder Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) verwendet, um die Bindungsstelle für die Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase (Gen 43-Protein) zu charakterisieren, die sich mit der Ribosom-Bindungsstelle in ihrer eigenen mRNA überlappt. Die Bindungsstelle enthält eine 8-Basis-Loop-Sequenz, die 65.536 randomisierte Varianten für die Analyse⁷darstellt. Zweitens wurde der Ansatz auch unabhängig verwendet, um zu zeigen, dass spezifische Bindungsstellen oder Aptamer für verschiedene Farbstoffe aus einem Pool von etwa 10¹³ Sequenzen⁸ausgewählt werden können. Tatsächlich wurde dieser Ansatz in vielen verschiedenen Kontexten verwendet, um Aptamer (RNA- oder DNA-Sequenzen) für die Bindung zahlreicher Liganden, wie Proteine, kleine Moleküle und Zellen, und für die Katalyse⁹zu identifizieren. Ein Aptamer kann beispielsweise zwischen zwei Xanthin-Derivaten, Koffein und Theophyllin, unterscheiden, die sich durch das Vorhandensein einer Methylgruppe in Koffein¹⁰unterscheiden. Wir haben diesen Ansatz (SELEX oder iterative Selektionsverstärkung) ausgiebig genutzt, um zu untersuchen, wie RNA-bindende Proteine in der Spleiß- oder Spleißverordnung¹¹funktionieren, was die Grundlage für die anschließende Diskussion bilden wird.

Die zufällige Bibliothek: Wir haben eine zufällige Bibliothek mit 31 Nukleotiden verwendet. Die Längenbetrachtung für die zuzufällige Bibliothek beruhte lose auf der Idee, dass der allgemeine Spleißfaktor U2AF⁶⁵ an eine Sequenz zwischen der Verzweigungspunktsequenz und der 3′ Spleißstelle bindet. Im Durchschnitt liegt der Abstand zwischen diesen Spleißsignalen in Metazoen im Bereich von 20 bis 40 Nukleotiden. Ein anderes Protein Sex-lethal war dafür bekannt, sich an eine schlecht charakterisierte regulatorische Sequenz in der Nähe der 3′ Spleißstelle seiner Ziel-Pre-mRNA, Transformator, zubinden. Daher wählten wir eine zufällige Region von 31 Nukleotiden, flankiert von Primerbindungsstellen mit Restriktionsenzymstellen, um die PCR-Verstärkung und Anhaftung des T7-RNA-Polymerase-Promotors für die In-vitro-Transkription zu ermöglichen. Die theoretische Bibliotheksgröße oder -komplexität betrug 4³¹ oder ungefähr 10¹⁸. Wir verwendeten einen kleinen Bruchteil dieser Bibliothek, um unseren zufälligen RNA-Pool (10¹²-10¹⁵) für die unten beschriebenen Experimente vorzubereiten.