Özet

Biopsia y vitrificación de blastocisto humano

Published: July 26, 2019
doi:

Özet

La biopsia de blastocisto y la vitrificación son necesarias para realizar pruebas genéticas preimplantacionales de manera eficiente. Un enfoque que implica la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 7-8 células de trophectoderm en el día 5-7 post-inseminación limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas.

Abstract

La biopsia de blastocisto se realiza para obtener un diagnóstico genético fiable durante los ciclos de FIV con pruebas genéticas preimplantacionales. A continuación, el flujo de trabajo ideal implica un protocolo de vitrificación seguro y eficiente, debido al tiempo de respuesta de las técnicas de diagnóstico y para transferir el embrión o embriones seleccionados en un endometrio fisiológico en un siguiente ciclo natural. Un enfoque de biopsia que abarca la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 5-10 células de trophectoderm (idealmente 7-8) limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas. Después del entrenamiento adecuado, la técnica fue reproducible entre diferentes operadores en términos de sincronización de la biopsia (8 min, que van 3-22 min en función del número de embriones a biopsia por plato), diagnósticos concluyentes obtenidos (97,5%) y las tasas de nacimientos vivos después de la transferencia de blastocisto euploide vitriloide (>40%). La tasa de supervivencia después de la biopsia, vitrificación y calentamiento fue tan alta como 99.8%. La tasa de reexpansión a 1,5 h del calentamiento fue tan alta como 97%, dependiendo en gran medida del momento entre la biopsia y la vitrificación (idealmente 30 min), la calidad morfológica del blastocisto y el día de la biopsia. En general, es mejor vitrifiar un blastocisto colapsado; por lo tanto, en ciclos no-PGT, la contracción artificial asistida por láser podría realizarse para inducir el colapso embrionario antes de la criopreservación. La perspectiva de futuro más prometedora es el análisis no invasivo de los medios de cultivo de FIV después del cultivo del blastocisto como fuente putativa de ADN embrionario. Sin embargo, esta vanguardia potencial todavía está en investigación y todavía es necesario definir y validar un protocolo fiable.

Introduction

El objetivo principal de la embriología humana moderna es maximizar el número de nacimientos vivos por ciclo estimulado y reducir los costos, el tiempo y los esfuerzos para lograr un embarazo. Para lograr este objetivo, se deben emplear enfoques validados para la selección de embriones para identificar embriones reproductivos competentes dentro de una cohorte obtenida durante un ciclo de FIV. Según las últimas pruebas, el cultivo de blastocisto1 combinado con pruebas cromosómicas exhaustivas y transferencia de embriones euploide (ET) calentada vitrificada es el marco más eficiente para aumentar la eficiencia de la FIV2. Claramente, las pruebas de aneuploidía requieren un espécimen embrionario, que en la actualidad se representa principalmente a partir de pocas células recuperadas del trophectoderrm (TE), es decir, la sección del blastocisto que da origen a los anexos embrionarios (por ejemplo, la placenta) durante el embarazo . Más allá del análisis del cariotipo, también se podrían evaluar mutaciones genéticas únicas a partir de una biopsia TE como parte de una estrategia clínica conocida como pruebas genéticas preimplantacionales (PGT; -A para aneuploidías, -SR para reordenamientos cromosómicos estructurales, -M para enfermedades monogénicas). Otros métodos de biopsia de ovocitos/embriones han sido teorizados y adoptados clínicamente a lo largo de las últimas décadas, a saber, biopsia de cuerpos polares y biopsia de blastomero. Sin embargo, su uso se reduce hoy en día, ya que sus inconvenientes procesales (por ejemplo, mayor carga de trabajo y riesgo de impacto reproductivo) y las limitaciones diagnósticas (por ejemplo, cuestiones de análisis de una sola célula) obstaculizan implícitamente un equilibrio suficiente entre los costos, los riesgos y beneficios (para una revisión ver3).

En este artículo, uno de los principales protocolos para la biopsia de TE se describe a fondo junto con los procedimientos posteriores de vitrificación, calentamiento y transferencia requeridos. El flujo de trabajo aquí descrito es ideal para una unidad PGT ocupada.

Como ya ha descrito anteriormente nuestro grupo4,5, el procedimiento implica la apertura secuencial de la zona pellucida de blastocistos completamente expandidos y la eliminación de pocas células TE (en promedio 7-8). En comparación con el método de biopsia de blastocisto basada en el sombreado asistida por láserdeldía 3, este procedimiento podría facilitar el horario diario de una unidad de FIV donde se deben realizar oportunamente procedimientos delicados, como la biopsia de blastocisto y la vitrificación. Tan pronto como el blastocisto alcanza su expansión completa, la biopsia se puede llevar a cabo seleccionando las células TE para extraer, evitando así el riesgo de hernia de la masa celular interna (ICM), lo que de otra manera haría que el procedimiento fuera un reto. En la literatura, también se ha descrito un tercer protocolo de biopsia de blastocisto, que implica la eclosión asistida por láser que se realiza una vez que el embrión ya ha alcanzado la etapa de blastocisto, pocas horas antes del procedimiento5,7. Sin embargo, este enfoque consume más tiempo y se adapta principalmente a las unidades de FIV que están implementando la biopsia TE en manos de operadores con experiencia limitada y en vista de una carga de trabajo diaria moderada-baja.

La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)8 debe ser una técnica consolidada si se trata de realizar análisis genéticos en ficticia. Del mismo modo, un sistema de cultivo adecuado para cosechar embriones de forma segura en la etapa de blastocisto es crucial para la implementación de la estrategia de biopsia TE. Un número adecuado de incubadoras, así como el uso de baja tensión de oxígeno son requisitos previos clave para este fin, no comprometer la tasa de blastocisto9. Al mismo tiempo, se necesita un programa de criopreservación eficiente para gestionar de forma segura un ciclo de PGT. En la última década, la implementación de la vitrificación ha impulsado las tasas de criosupervivencia embrionaria hasta >99%10,11. Esto proporcionó tiempo suficiente para realizar pruebas genéticas y posponer la transferencia de embriones al siguiente ciclo menstrual, en un endometrio no estimulado y probablemente más receptivo12.

Tanto la biopsia de TE como la vitrificación son tareas exigentes que requieren habilidades estrictas y su eficacia puede variar entre operadores sin experiencia. Por lo tanto, se aboga un período de formación específico antes de permitir que cada operador realice estos procedimientos clínicamente; además, el mantenimiento de las habilidades de los operadores debe evaluarse periódicamente mediante el seguimiento de indicadores clave de rendimiento (KPI) para los procedimientos de criopreservación y biopsia. Cada clínica de FIV debe establecer KPI internos para este fin, que deben aproximarse a los publicados por consorcios internacionales y/o los resultados publicados por los laboratorios de referencia.

La biopsia TE, el calentamiento de la vitrificación y los procedimientos de testimonio son técnicas validadas en nuestra unidad, que se han estandarizado en todos los operadores involucrados según se informó en tres publicaciones anteriores11,13,14 .

Protocol

El protocolo para la biopsia de blastocisto humano, aquí descrito, sigue las directrices del Comité Ético de Investigación Humana de G.EN.E.R.A. NOTA: Consulte la Tabla de materiales para conocer los materiales necesarios. El material adicional requerido incluye calzado y atuendo de laboratorio, mascarilla quirúrgica, cubierta capilar, guantes quirúrgicos, un marcador permanente no tóxico, fórceps y desinfectante. El uso de bata quirúrgica, guantes qu…

Representative Results

La Figura 6 representa un esquema de todos los resultados de un procedimiento de biopsia que se puede adoptar para estandarizar el protocolo y monitorear el rendimiento de cada operador. El principal resultado procedimental es el momento para completar la biopsia/biopsias; el principal resultado técnico es la calidad de la trama producida después de pruebas genéticas que podrían resultar en un diagnóstico concluyente o no concluyente, el último de los c…

Discussion

Sólo los embriólogos experimentados que hayan completado su período de entrenamiento deben realizar tanto la biopsia TE como la vitrificación del blastocisto. Además, se requiere un testigo para monitorear los procedimientos y garantizar una trazabilidad eficiente durante i) los movimientos del blastocisto biopsiado desde la antena de biopsia (FiguraSuplementaria 1) a la antena post-biopsia (FiguraSuplementaria 1 ), a continuación a la placa de vitrificación (Figurasupleme…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AG y RM recopilaron los datos y redactaron el manuscrito. DC analizó los datos, redactó los resultados representativos, realizó las estadísticas y revisó el manuscrito. FMU y LR proporcionaron una discusión crítica de los resultados y de todo el manuscrito.

Materials

Equipment
Cold tube rack Biocision XTPCR96
Electronic pipette controller Fisher Scientific 710931
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
IVF Electronic Witness System CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions RI Witness ART Management System
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Laser objective RI Saturn 5
Microinjectors Nikon Narishige NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes Eppendorf CSLQSPIN for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermostat Panasonic MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Consumables
Biopsy pipette RI 7-71-30FB35720 30µm ID, flat 35°C
Cryolock Cryolock CL-R-CT
CSCM complete Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter Cook G17934
Flexipet pipette Cook G26712 140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette Cook G46020 300µm stripping pipette tips
Holding pipette RI 7-71-IH35/20 30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin Irvine Scientific 9988
IVF One well dish Falcon 353653
Mineral Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Irvine Scientific 90126 Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface Thermofisher scientific 176740 IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish Corning 353802 60x15mm
Reproplate Kitazato 83016
Serological pipette Falcon 357551 10ml
Sterile disposable Gilson tips Eppendorf 0030 075.021 200µl
Tubing Kit Provided by the genetic lab PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media Kitazato VT801 Equilibration and vitrification solutions
Warming media Kitazato VT802 Thawing and dilution solutions

Referanslar

  1. Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
  2. Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  3. Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
  4. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  5. Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
  6. McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
  7. Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
  8. Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
  9. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  10. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  11. Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
  12. Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
  13. Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
  14. Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
  15. Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
  16. Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
  17. de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
  18. Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
  19. McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
  20. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  21. Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
  22. Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  23. Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
  24. Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).

View Video