Özet

ביופסיה של האדם בלסטוציסטה וויטריפיקציה

Published: July 26, 2019
doi:

Özet

ביופסיה blastocyst ו ויטריפיקציה נדרשים ביעילות לבצע בדיקה גנטית מראש השרשה. גישה הדורשת את הפתיחה הרציפה של הסונה והחזרת התאים ה7-8 של תאי העור ביום 5-7 שלאחר ההפריה מגבילה גם את מספר המניפולציות הנדרשות ואת חשיפת העובר לתנאי הסביבה האופטימליים.

Abstract

ביופסיה blastocyst מבוצעת כדי לקבל אבחנה גנטית אמינה במהלך מחזורי IVF עם השרשה גנטית בדיקות. אז, זרימת העבודה האידיאלית כרוך פרוטוקול ויטריפיקציה בטוח ויעיל, בשל זמן הטיפול של טכניקות אבחון ולהעביר את העובר הנבחר (של) על רירית המין הפיזיולוגי במחזור הטבעי הבא. גישה ביופסיה המקיף את הפתיחה רציפים של הסונה pellucida ושליפה של 5-10 תאי עור trophectoderm באופן אידיאלי 7-8) מגביל הן מספר המניפולציות הנדרשות ואת החשיפה של העובר לתנאים סביבתיים תת אופטימלית. לאחר אימון נאות, הטכניקה היתה להיות מיויית על פני מפעילי שונים במונחים של עיתוי של ביופסיה (~ 8 דקות, החל 3-22 דקות מבוסס על מספר העוברים ביופסיה לכל מנה), אבחנות מכרעת שהתקבלו (~ 97.5%) ושיעורי לידה חיים לאחר העברת-העברה שחומם-אאופואיד-בליילויד (> 40%). שיעור ההישרדות לאחר ביופסיה, ויטריפיקציה והתחממות היה גבוה כמו 99.8%. שיעור ההתרחבות מחדש ב 1.5 h מהתחממות היה גבוה כמו 97%, תלוי בעיקר בעיתוי בין ביופסיה ו ויטריפיקציה (באופן אידיאלי ≤ 30 דקות), בלסטוציסט באיכות וביום של ביופסיה. באופן כללי, עדיף להתקשות לכווץ בלסטוציסטה; לכן, במחזורים שאינם PGT, לייזר בסיוע מלאכותי הצטמקות עשוי להתבצע כדי לגרום לקריסה העובר לפני הקפאת ההזמנה. הפרספקטיבה העתידית המבטיחה ביותר היא ניתוח לא פולשני של התקשורת התרבותית IVF לאחר התרבות בלסטוציסט כמקור פיוטי של דנ א עובריים. עם זאת, האוונגרד הפוטנציאלי הזה עדיין תחת חקירה ופרוטוקול אמין עדיין צריך להיות מוגדר ומאומת.

Introduction

המטרה העיקרית של אמבריולוגיה האנושי המודרני היא למקסם את המספר לידות חי לכל מחזור מגורה ולהפחית עלויות, זמן ומאמצים כדי להשיג הריון. כדי להשיג מטרה זו, גישות מאומתות עבור בחירת העובר צריך להיות מועסק כדי לזהות עוברים מוכשרים מחדש בתוך מפרק שהושג במהלך מחזור IVF. על פי העדויות האחרונות, התרבות בלסטוציסט1 בשילוב עם בדיקות כרומוזומלית מקיפה-העברת העובר התחמם העברה (ET) היא המסגרת היעילה ביותר כדי להגדיל את יעילות IVF2. ברור, בדיקות אנאפלואידיה דורש דגימה עובריים, אשר בשלב זה מיוצג בעיקר מתאים מעטים שאוחזרו מן הטרופטועור (TE), כלומר, את הקטע של הבלסטוציסטה המעניקה מקור לספח העובר (למשל, השליה) במהלך ההריון . מעבר ניתוח קריוטיפ, גם מוטציות גן יחיד עשוי להיות מוערך מתוך ביופסיה TE כחלק אסטרטגיה קלינית המכונה השתלת מראש בדיקות גנטיות (pgt;-a עבור aneuploidies,-SR עבור הסדרים מבניים כרומוקטיביות,-M עבור מחלות מונוגניים). אחרים oocyte/העובר ביופסיה שיטות כבר תיאוריה ואימץ קלינית לאורך העשורים האחרונים, כלומר גופים קוטביים ביופסיה ו blastomere ביופסיה. עם זאת, השימוש שלהם מופחת כיום מאז החסרונות הפרוצדורליים שלהם (למשל, עומס עבודה גבוה יותר וסיכון להשפעה הרבייה) ומגבלות אבחון (g., ניתוח תא בודד בעיות) לעכב במרומז איזון מספיק בין עלויות, סיכונים יתרונות (עבור סקירה ראה3).

במאמר זה, אחד הפרוטוקולים העיקריים של TE ביופסיה מתוארת ביסודיות יחד עם ויטריפיקציה הבאים, מחמם והעברת הליכים נדרשים. זרימת העבודה כאן מחולקת היא אידיאלית עבור יחידת PGT עמוסה.

כפי שתואר כבר בעבר על ידי הקבוצה שלנו4,5, ההליך כרוך פתיחה רציפה של הסונה pellucida של לחלוטין מורחב בלסטוציסטות והסרה של תאים TE מעטים (בממוצע 7-8). בהשוואה ליום 3 לייזר בסיוע בקיעה מבוסס ביופסיה שיטה6, הליך זה עשוי להקל על לוח הזמנים היומי של יחידת IVF שבו הליכים עדינים, כגון ביופסיה בלסטוציסט ו ויטריפיקציה, חייב להתבצע בעיתוי. ברגע שהציסטה הבלסטובה מגיעה להתרחבות המלאה שלה, הביופסיה יכולה להתבצע על ידי בחירת תאי ה-TE כדי להסיר, ובכך למנוע את הסיכון לפריצת המסה של התא הפנימי (ICM), אשר אחרת להפוך את ההליך מאתגר. בספרות, פרוטוקול שלישי של ביופסיה בלסטוציסט תוארה גם, אשר כרוכה הבקיעה בסיוע לייזר להתבצע פעם העובר כבר הגיע לשלב בלסטוציסט, כמה שעות לפני ההליך5,7. עם זאת, גישה זו היא יותר זמן רב ובעיקר חליפות IVF כי הם ביצוע ביופסיה TE בידיים של מגבילים מנוסים מנוסה ולאור עומס עבודה יומי מתון נמוך.

הזרקת זרע תאיים (ICSI)8 צריכה להיות טכניקה מאוחדת אם מכוון לביצוע ניתוחים גנטיים בהפריה חוץ גופית. באופן דומה, מערכת התרבות הנכונה לקצור בבטחה עוברים לשלב בלסטוציסט הוא חיוני ליישום של האסטרטגיה ביופסיה TE. מספר הולם של אינקובטורים, כמו גם השימוש במתח חמצן נמוך הם תנאי מפתח למטרה זו, לא להתפשר על שיעור בלסטוציסטה9. באותו זמן, תוכנית הקריוגנית יעילה נדרשת כדי לנהל בבטחה מחזור PGT. בעשור האחרון, יישום ויטריפיקציה יש שיפרה העובר שיעורי ההישרדות אפילו עד > 99%10,11. זה סיפק זמן מספיק כדי לבצע בדיקות גנטיות ולדחות העברת העובר אל המחזור הווסת הבא, על לא מגורה וכנראה יותר רירית האנדויום12.

הן ביופסיה ו-ויטריפיקציה הם תובעניים משימות הדורשות מיומנויות קפדניות והאפקטיביות שלהם עשוי להשתנות בין אופרטורים לא מנוסים. תקופת הכשרה מסוימת היא לפיכך מאפשרת לכל מפעיל לבצע הליכים אלה קלינית; יתר על כן, התחזוקה של מיומנויות המפעילים צריך להיות מוערך מעת לעת על ידי ניטור מחוונים ביצועים מפתח (KPI) עבור הקפאת הזמנות ונוהלי ביופסיה. כל מרפאת IVF צריך להגדיר מחווני Kpi פנימיים למטרה זו, אשר חייב להיות מקורב אלה שפורסמו על ידי קונסורציומים הבינלאומי ו/או את התוצאות שפורסמו על ידי מעבדות התייחסות.

TE ביופסיה, הליכים ויטריפיקציה-התחממות ועדים הם טכניקות מאומת ביחידה שלנו, כי כבר מתוקננת על פני כל המפעילים מעורבים כדיווח בשלוש פרסומים קודמים11,13,14 .

Protocol

הפרוטוקול עבור ביופסיה של האדם בלסטוציסטה, כאן תיאר, עוקב אחר ההנחיות של הוועדה האנושית E.R.A. המחקר האנושי. הערה: עיין בטבלת חומרים לחומרים הנדרשים. חומר נוסף נדרש כרוך הנעלה מעבדה התלבושת, מסכת מסיכה כירורגית, כיסוי שיער, כפפות כירורגי, סמן קבוע לא רעיל, מלק?…

Representative Results

איור 6 מייצג ערכה של כל התוצאות של הליך ביופסיה שניתן לאמץ כדי לתקנן את הפרוטוקול ולנטר את הביצועים של כל אופרטור. התוצאה הפרוצדורלית העיקרית היא העיתוי להשלמת ביופסיה/ביופסיות; התוצאה הטכנית העיקרית היא האיכות של העלילה המיוצר לאחר בדיקות גנטיות שעשוי ל…

Discussion

רק embryologists מיומנים מנוסים שסיימו את תקופת ההכשרה שלהם צריך לבצע הן TE ביופסיה ו בלסטוציסט ויטריפיקציה. יתרה מזאת, על העד לפקח על ההליכים ולהבטיח שעקיבות יעילה במהלך הזמן שאני מבצע את התנועות של ביופסיה מצלחת הביופסיה (איור משלים 1) לצלחת הפוסט-ביופסיה (איור משלים 1) ), ואז לצ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AG ו-RM אספו את הנתונים וניסחו את כתב היד. DC ניתח את הנתונים, ניסח את תוצאות הנציגים, ביצע את הסטטיסטיקות ושינו את כתב היד. FMU ו-LR סיפקו דיון קריטי בתוצאות ובכל כתב היד.

Materials

Equipment
Cold tube rack Biocision XTPCR96
Electronic pipette controller Fisher Scientific 710931
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
IVF Electronic Witness System CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions RI Witness ART Management System
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Laser objective RI Saturn 5
Microinjectors Nikon Narishige NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes Eppendorf CSLQSPIN for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermostat Panasonic MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Consumables
Biopsy pipette RI 7-71-30FB35720 30µm ID, flat 35°C
Cryolock Cryolock CL-R-CT
CSCM complete Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter Cook G17934
Flexipet pipette Cook G26712 140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette Cook G46020 300µm stripping pipette tips
Holding pipette RI 7-71-IH35/20 30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin Irvine Scientific 9988
IVF One well dish Falcon 353653
Mineral Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Irvine Scientific 90126 Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface Thermofisher scientific 176740 IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish Corning 353802 60x15mm
Reproplate Kitazato 83016
Serological pipette Falcon 357551 10ml
Sterile disposable Gilson tips Eppendorf 0030 075.021 200µl
Tubing Kit Provided by the genetic lab PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media Kitazato VT801 Equilibration and vitrification solutions
Warming media Kitazato VT802 Thawing and dilution solutions

Referanslar

  1. Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
  2. Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  3. Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
  4. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  5. Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
  6. McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
  7. Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
  8. Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
  9. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  10. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  11. Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
  12. Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
  13. Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
  14. Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
  15. Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
  16. Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
  17. de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
  18. Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
  19. McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
  20. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  21. Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
  22. Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  23. Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
  24. Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).

View Video