神经递质改变是一种神经功能障碍的机制,发生在脑震荡后,并造成有时灾难性的长期后果。这种大鼠模型结合了微透析,允许体内神经递质定量,与重量下降技术,以快速加速和减速的头部和躯干,人类颅骨创伤的一个重要因素。
持续的认知和运动症状是脑震荡/轻度创伤性脑损伤 (mTBIs) 的已知后果,可部分归因于神经传播的改变。事实上,对啮齿动物的脑微透析研究表明,在创伤后的前10分钟内,海马体内细胞外谷氨酸释放过多。微透析具有在体内神经递质连续采样的明显优势,同时无需牺牲动物。除了上述技术,需要一个封闭的头部损伤模型,使头部和躯干快速加速和减速,因为这个因素在很多其他动物模型中是不可用的。韦恩州降重模型模仿人类颅骨创伤的这一基本组成部分,允许对体重下降的无节制的啮齿动物的头部产生冲击。我们新颖的转化大鼠模型将脑微透析与韦恩州降重模型相结合,研究在轻度麻醉和无节制的成年大鼠中,脑震荡后细胞外神经递质水平的急性变化。在此协议中,微透析探针作为感兴趣的区域插入海马内部,并在撞击时留在大脑中。海马体内的终端和受体密度很高,因此是记录脑震荡后神经传播变化的相关区域。当应用于成年斯普拉格-道利大鼠时,我们的联合模型诱导海马细胞外谷氨酸浓度在前10分钟内增加,与先前报道的脑震荡后症状学一致。这种组合的降压模型为研究人员提供了一个可靠的工具,可以研究除了重复性脑损伤外,对脑震荡的早期治疗反应,因为此方案会导致闭头轻度创伤。
这种方法的目的是为研究人员提供一个可靠的工具,忠实地再现人类颅脑创伤的生物力学,同时允许对脑震荡/轻度创伤性大脑的分子效应进行纵向表征。伤害(mTBIs)。该方法将脑微透析与韦恩州降重模型相结合,记录在轻度麻醉和无节制的成年大鼠中,脑震荡后细胞外神经递质水平的急性变化。使用这种微创方法,神经递质,如谷氨酸,GABA,牛磺酸,甘氨酸和丝氨酸可以在创伤后,在体内快速和持续量化,而不必牺牲动物。
脑震荡/mTBI是一种由外力机制引起的影响大脑功能的病理生理障碍。脑震荡/mTBI是最常见的创伤性脑损伤形式,占1例的70-90%。脑震荡后的大部分急性功能中断可归因于原发性脑损伤2、3 :(1)原发性脑损伤是由头部和躯干的快速加速和减速引起的。通过压缩损害脑组织,随后在反弹4、5、6和(2)期间拉伸和剪切斧子,继发性脑损伤是细胞对创伤的间接反应。它发生在原发性脑损伤后的几个小时和几天,在运动和认知障碍中扮演着重要的角色。许多症状可归因于改变的神经传播,如先前证明在受伤后7,8,9在伤害后的前10分钟内过度细胞外谷氨酸释放。由于其终端和受体的高密度,海马是一种大脑结构,特别容易受到损伤后这种兴奋性反应的影响。大量参与认知功能10,11,研究啮齿动物报告,海马损伤与脑震荡可能导致损伤在恐惧调节和学习空间记忆12 ,13.该方法的主要目标是制定出一个大鼠的脑震荡模型/mTBI,使用韦恩州闭头降压程序忠实地再现主要脑损伤的机制,并纳入脑微透析研究体内,急性细胞外神经递质因脑震荡后继发性脑损伤而变化。在海马区测量细胞外谷氨酸和GABA的浓度,作为我们方法的代表性结果。
以前的啮齿动物研究将微透析和其他损伤模型(如开头骨重量下降和控制皮质冲击)结合起来,以证明在不同程度严重的损伤后细胞外神经递质水平的急性变化14度,15度,16度,17度。然而,除了高变异性之外,开放颅骨重量下降和控制皮质冲击等模型的转化价值也因2个因素而固有的生态有效性缺失而受到阻碍:(1)这些模型在很大程度上诱发了伤害比运动相关的脑震荡在人类遭受更严重,涉及直接大脑加载和(2)这些模型需要颅切除术或颅骨切除术,啮齿动物的头被完全限制在立体框架,阻碍快速头部和躯干加速和减速,因此缺乏脑震荡的生物力学。
微透析是一种微创方法,它具有对谷氨酸、GABA、牛磺酸、甘氨酸和丝氨酸等神经递质进行采样的明显优势,在体内和持续创伤后,同时不必牺牲动物。除了微透析的优势外,韦恩州立大学还开发了一种闭骨滴式(与其他模型的开放式头骨相比),它允许在轻度麻醉和无节制的啮齿动物上感应mTBI,从而允许头部和躯干的快速加速和减速18。如前所述,头部和躯干加速和减速是运动相关脑震荡的核心生物力学特征,以前啮齿动物mTBI模型未能解决。降重程序可以非常迅速地完成,不需要任何以前的手术或头皮切口。脑震荡诱导后,啮齿动物几乎自发地恢复右反射,在一次撞击后不会感到瘫痪、癫痫发作或呼吸窘迫。颅内出血和颅骨骨折很少,只有小缺陷的运动协调报告在啮齿动物。这种大鼠模型易于使用,价格低廉,有助于在脑震荡后急性阶段释放的神经递质的定量,而不会在撞击过程中去除微透析探针。
我们的大鼠模型结合了微透析和脑震荡,适合寻求纵向描述脑震荡分子效应的研究人员,并可用于各种治疗性研究。事实上,尽管经过几年的研究和压倒性的需求,没有药物,以防止脑震荡的长期影响已经通过了临床试验阶段19。造成这些失败的潜在原因之一可能是使用动物模型,这些模型不能忠实地再现人类经历的脑震荡的创伤性生物力学力量。这里介绍的方法符合人类脑震荡的定义,该定义规定,主要脑损伤是由钝冲击以及头部和躯干2、3的快速加速和减速引起的。
此外,我们的组合模型适合研究人员研究反复轻度创伤性脑损伤 (rmTBI) 的影响,因为它的主要特征之一,使其区别于其他动物的脑震荡模型是,它使它有可能诱导重复,轻微伤害同一案件18。在人类中,rmTBI与更严重的创伤后症状、更长的恢复时间以及加重的运动和认知障碍有关,这些障碍往往在时间20、21之间扩散。其他相关的动物模型也使得更好地了解rmTBI 22,23,24,25,26,27的创伤后病理生理学成为可能.在24小时间隔至少5 mTBI后,啮齿动物的大脑脆弱性增加。神经炎症增加,经历的mTBI和神经退化的标记出现28。重复的mTBI将阻止微胶质从临炎模式过渡到正常恢复模式,导致长期兴奋活性和神经退行机制的激活29。根据我们的模型,大鼠在1周内每天可能遭受1次撞击,总共5次。鉴于这种动物模型的简单性,它可以促进在mTBI之后立即产生的急性滥杀性神经递质释放的累积效应的表征。
这种模式还允许动物每天容易受到2次撞击,从而可以研究更严重的情况,例如当运动员在第一次打击30后的短时间内收到另一次创伤性撞击时。正如先前的研究31所证明的,第二次打击头部的时机可以显著影响血管和斧头损伤。第二次打击越接近第一次打击,后果就越严重。此模型适用于研究此特定情况如何影响细胞外神经递质释放。
在这种方法中,海马作为感兴趣的区域,由于其在脑震荡研究的相关性,但微透析样本也可以从其他感兴趣的区域收集。然而,任何其他大脑区域必须考虑由于撞击点从导管留下的空间,包括周围的牙科水泥,可以占用老鼠的头部相当大的空间。此外,该方法提出的微透析参数,如膜的分子量截止和活性长度、采样时间间隔和流速,可根据所研究的分子类型进行调整。例如,有效收集脑震荡中涉及的亲炎细胞因子需要孔径大得多的膜。
协议中的关键步骤
为了生成可靠的结果,此协议中的关键步骤需要特别注意。在管状植入手术中,避免使用超过必要的水泥,特别是当它是非常液体,以防止溢出冲击部位。为避免阻塞植入部位,请使用与导管长度相同的锥体。在微透析过程中,将探头缓慢插入导管,并确保将其完全插入以进行透析检测。在脑震荡感应之前,确保铝板用锋利的剃刀刀片正确开槽。否则,黄铜重量的影响将不足以撕裂铝板,大鼠将保持胸部向下,而不是经历 180° 旋转和降落在其背部。如果是这种情况,由钝冲击引起的伤害,与开放式骨量下降模型中所见的一样,并且明显更严重。在脑震荡诱导期间,避免用重量撞击导管,因为这将对大鼠的头骨造成严重损害。强烈建议在 2 组中工作,以在实验期间限制操作错误。
修改和故障排除
在微透析过程中,一旦探头与泵连接,流量应恒定,并产生与灌注速率相适应的体积。较低的体积可能表示探头膜中存在堵塞或管路出现气泡。在堵塞的情况下,应丢弃并更换探头。但是,气泡可以通过在管路中循环 ACSF 来弹出。如果没有堵塞或气泡注意到,仍然没有流动,流出管最接近末端的一小部分可以切割。
方法的限制
其他使用韦恩州立大学重量下降的研究已经评估了一些基本的结构和分子变化18。然而,进行更广泛的调查将维持这一程序的合法性。有关在表观遗传和细胞水平上发生的生物和神经解剖学变化的信息将进一步巩固我们方法的可靠和转化价值。此外,认知功能评价是啮齿类模型33中mTBI相关结果的可靠指标。虽然右时间是在本协议中测量的,与假病例相比,在受伤病例中明显延迟,但未来的研究应侧重于有条不紊地测量啮齿动物创伤诱导后的认知功能。
该方法相对于现有/替代方法的重要性。
该方法的主要意义有两方面:首先,它允许使用韦恩州立大学的程序成功地诱导脑震荡,从而允许头部和躯干的快速加速和减速。采用这种方法,避免了严重损伤结果,如心肺骤停、颅骨骨折、高死亡率和撞击部位可见脑挫伤的迹象。其次,这种微透析技术成功地复制了先前证明的急性和短寿命细胞外谷氨酸释放发生在创伤诱导14、16后的前10分钟内。此外,在整个过程中保持探头插入可显著降低与重复微透析探针插入相关的mTBI敏感血脑屏障受损的可能性34。
方法的未来应用程序或方向。
鉴于韦恩州立大学降重手术的易用方面以及微透析测量的急性细胞外神经递质水平变化,我们的大鼠模型结合微透析和脑震荡,为研究人员提供了可靠的工具忠实地再现人类颅脑创伤的生物力学,并纵向描述脑震荡的分子效应。我们的大鼠模型也可用于各种治疗性研究,因为它提供了一个宝贵的机会,研究药理剂在体内的机制和效力,连续,而无需牺牲动物。此外,像这里介绍的老鼠模型的可用性可以大大有助于更好地了解神经递质不平衡与脑震荡的行为后果之间的关系。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢路易·基奥奇奥的动物护理和维护,摩根·雷格尼斯协助心脏内灌注手术,大卫·卡顿瓜伊协助冷冻。这项工作得到了蒙特利尔大学急性创伤学基金会主席卡罗琳·杜兰的支持。
Animal Preparation | |||
Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery | |||
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
Ophthalmic Ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
Stereotaxic Frame | Stoelting | 51600 | |
Stereotaxic Cannula Holder Arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Cannula Gauge 20 10.55mm | HRS Scientific | C311G/SPC | |
Dummy-Cannula 10.55mm | HRS Scientific | C311DC/1/SPC | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Microdialysis Procedure | |||
CMA 402 Syringe Pump | Harvard Apparatus Canada | CMA-8003110 | |
Microsyringe 2.5ml Glass | Harvard Apparatus Canada | CMA-8309021 | |
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml | Harvard Apparatus Canada | CMA-3408310 | |
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel | Instech Laboratories Inc. | 375/D/22QM | |
GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps | Fisher Scientifique | 05769Q | |
NaHCO3 Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich Canada | S5761-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
MgCl2 Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | M8266-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
NaCl Sodium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | S7653-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich Canada | A5960-25G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
KCl Potassium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | P9333-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Canada | S0751-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
CaCl2 Calcium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | 383147-100G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
Lighter | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
Epoxy Glue | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
Super Glue Gel | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
Cut-Off Wheels Dremel #409 | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 | Fisher Scientifique | 14-826-15 | For Laboratory Constructed Probes |
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 | Fisher Scientifique | 14-826-5B | For Laboratory Constructed Probes |
26G Stainless Steel Tubing One Foot | HRS Scientific | SST-26/FT | For Laboratory Constructed Probes |
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID | HRS Scientific | C315CT | For Laboratory Constructed Probes |
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID | HRS Scientific | C314CT | For Laboratory Constructed Probes |
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID | HRS Scientific | C313CT | For Laboratory Constructed Probes |
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long | HRS Scientific | 008BSH/30S | For Laboratory Constructed Probes |
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm | Molex LLC Polymicro Technologies | 106815-0015 | For Laboratory Constructed Probes |
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO | Spectrum Labs | FSSP9778671 | For Laboratory Constructed Probes |
Stainless Steel Collar | Sirnay In.c | 304 | For Laboratory Constructed Probes / Custome made |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Concussion Apparatus | |||
Brass Weight | Rapido Métal Inc. | Attach metal loop to base | |
Metal Loop | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
PVC Guide Tube | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
Tape | Available commercially | ||
GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
U-Shaped Plexiglas Frame | Présentoirs PlexiPlus Inc. | Custom made | |
Foam Cushion | Mousse D&R Foam Inc. | Custom made | |
Razor Blades | VWR International | 55411-055 | |
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley | Canadian Tire | Available at most hardware stores | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Stop Watch | Available at most sporting goods retailer |
Animal Preparation | |||
Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery | |||
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
Ophthalmic Ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
Stereotaxic Frame | Stoelting | 51600 | |
Stereotaxic Cannula Holder Arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Cannula Gauge 20 10.55mm | HRS Scientific | C311G/SPC | |
Dummy-Cannula 10.55mm | HRS Scientific | C311DC/1/SPC | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Microdialysis Procedure | |||
CMA 402 Syringe Pump | Harvard Apparatus Canada | CMA-8003110 | |
Microsyringe 2.5ml Glass | Harvard Apparatus Canada | CMA-8309021 | |
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml | Harvard Apparatus Canada | CMA-3408310 | |
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel | Instech Laboratories Inc. | 375/D/22QM | |
GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps | Fisher Scientifique | 05769Q | |
NaHCO3 Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich Canada | S5761-500G | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
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NaCl Sodium Chloride | Sigma-Aldrich Canada | S7653-1KG | For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) |
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Lighter | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
Epoxy Glue | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
Super Glue Gel | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
Cut-Off Wheels Dremel #409 | Canadian Tire | For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores | |
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 | Fisher Scientifique | 14-826-15 | For Laboratory Constructed Probes |
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Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID | HRS Scientific | C314CT | For Laboratory Constructed Probes |
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID | HRS Scientific | C313CT | For Laboratory Constructed Probes |
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long | HRS Scientific | 008BSH/30S | For Laboratory Constructed Probes |
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Stainless Steel Collar | Sirnay In.c | 304 | For Laboratory Constructed Probes / Custome made |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Concussion Apparatus | |||
Brass Weight | Rapido Métal Inc. | Attach metal loop to base | |
Metal Loop | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
PVC Guide Tube | Rona Inc. | Available at most hardware stores | |
Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
Tape | Available commercially | ||
GSC Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientifique | S13748 | |
U-Shaped Plexiglas Frame | Présentoirs PlexiPlus Inc. | Custom made | |
Foam Cushion | Mousse D&R Foam Inc. | Custom made | |
Razor Blades | VWR International | 55411-055 | |
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley | Canadian Tire | Available at most hardware stores | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Stop Watch | Available at most sporting goods retailer |