Localisation des protéines modifiées par SUMO à l’aide de protéines de piégeage du sumo fluorescent
Özet
Le SUMO est une protéine modificatrice essentielle et très conservée, de petite taille, comme l’ubiquitine. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’une protéine de piégeage de SUMO recombinant tolérante au stress (kmUTAG) pour visualiser les conjugués de SUMO natifs et non marqués et leur localisation dans une variété de types de cellules.
Abstract
Nous présentons ici une nouvelle méthode pour étudier la sumoylation des protéines et leur localisation sous-cellulaire dans les cellules de mammifères et les ovocytes des nématodes. Cette méthode utilise un fragment de protéine de piégeage de SUMO modifié recombinant, kmUTAG, dérivé de la protéase de SUMO Ulp1 de la levure de bourgeonnement tolérante au stress Kluyveromyces marxianus. Nous avons adapté les propriétés de la kmUTAG dans le but d’étudier la sumoylation dans une variété de systèmes modèles sans l’utilisation d’anticorps. Pour l’étude de SUMO, KmUTAG a plusieurs avantages par rapport aux approches basées sur les anticorps. Ce réactif de piégeage du SUMO à tolérance de stress est produit de façon recombinante, il reconnaît les isoformes de SUMO indigènes de nombreuses espèces, et contrairement aux anticorps disponibles dans le commerce, il montre une affinité réduite pour le SUMO libre et non conjugué. Les résultats représentatifs présentés ici comprennent la localisation des conjugués SUMO dans les cellules de culture tissulaire de mammifères et les ovocytes de nématodes.
Introduction
Le but de cette méthode est de faciliter l’étude et l’analyse des protéines conjuguées au SUMO à l’aide de la protéine recombinante SUMO-piégeage UTAG ( étiquettede domaineULP). Comme détaillé ci-dessous, UTAG peut être utilisé en lieu et place d’autres réactifs et approches pour purifier, détecter et visualiser les protéines modifiées par le SUMO. Selon les conditions de croissance, les cellules peuvent contenir des centaines ou des milliers de protéines qui sont modifiées avec les chaînes SUMO ou SUMO (pour examen voir Kerscher et al. 20061 et kerscher 20162). Cela représente une difficulté considérable pour les analyses fonctionnelles de protéines spécifiques de SUMO, d’autant plus que seule une fraction d’une cible de sumoylation particulière est réellement modifiée3. En plus de leurs rôles dans les processus cellulaires essentiels tels que la régulation transcriptionnelle, l’homéostasie des protéines, la réponse au stress cellulaire, et le remodelage de la chromatine pendant la mitose et la méiose; Il est maintenant devenu suffisamment clair que le sumo, les protéines modifiées par le sumo et les composants de la voie de sumo ont également un potentiel comme biomarqueurs pour des pathologies telles que le cancer et les troubles neurodégénératifs4,5,6 ,7. Cela souligne la nécessité d’outils robustes, fiables et facilement disponibles et d’approches novatrices pour la détection et l’analyse fonctionnelle des protéines modifiées par le SUMO dans une variété de cellules et d’échantillons.
Dans de nombreux systèmes, les anticorps spécifiques au sumo sont les réactifs de choix pour la détection, l’isolement et les analyses fonctionnelles des protéines modifiées par le sumo8,9. Cependant, certains anticorps spécifiques au SUMO disponibles dans le commerce sont coûteux, limités en quantité ou en disponibilité, enclins à présenter des affinités à variables sauvagement et une réactivité croisée, et, dans certains cas, manquent de reproductibilité10. Une autre approche est l’expression du SUMO marqué par l’épitope dans les cellules et les organismes transformés, mais la liaison des étiquettes d’épitope au SUMO peut artificiellement abaisser sa conjugaison aux cibles protéiques11. En outre, les épitopes ne sont pas utiles lorsque des cellules ou des tissus non transformés sont évalués.
Ulp1 est une protéase de SUMO conservée de S. cerevisiae qui les deux traite le précurseur de sumo et desumoylates les protéines conjuguées de sumo12. Nous avons développé le réactif UTAG sur la base de l’observation fortuit qu’une mutation de la cystéine catalytique (C580S) dans Ulp1’s traitement SUMO ULP domain (UD) non seulement prévient le clivage du sumo, mais piège également les protéines conjuguées au Sumo avec des l’avidité12. Pour simplifier, nous nous sommes référés à ce fragment carboxy-terminal SUMO-piégeage Ulp1 (C580S) comme UTAG (abréviation de UD TAG). UTAG est une protéine de piégeage de Pan-SUMO recombinante qui représente une alternative utile aux anticorps anti-SUMO utilisés pour l’isolement et la détection des protéines modifiées par le SUMO. Plus important encore, il reconnaît spécifiquement le SUMO en mode natif, conjugué et non pas seulement un ou plusieurs épitopes sur SUMO. Pour améliorer à la fois la stabilité protéique et la force de liaison SUMO de UTAG, nous avons généré une variante de l’UTAG de la levure tolérante au stress Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG lie étroitement les conjugués de SUMO à l’affinité nanomolaire13. De plus, kmUTAG résiste aux températures élevées (42 ° c), aux agents réducteurs (chlorhydrate de 5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) phosphine), aux dénaturants (jusqu’à 2 M d’urée), aux agents oxydants (0,6% de peroxyde d’hydrogène) et aux détergents non ioniques. Cette tolérance au stress est bénéfique pendant l’état de purification sévère et les durées d’incubation prolongées, assurant sa stabilité et son activité de piégeage du SUMO. Toutefois, il n’est pas surprenant que l’activité de piégeage de SUMO de KmUTAG soit incompatible avec les réactifs modifiant la cystéine, les détergents ioniques et les extraits protéiques entièrement dénaturés. L’affinité et les propriétés remarquables de KmUTAG indiquent que ce réactif peut faire partie du répertoire standard pour l’étude des protéines sumoylées chez plusieurs espèces.
Nous fournissons ici une méthode simple pour détecter les protéines modifiées par le SUMO dans les cellules de mammifères et les nématodes à l’aide d’une protéine de fusion mCherry-KmUTAG fluorescente recombinante (kmUTAG-FL).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous introduisons l’utilisation de kmUTAG-FL, une protéine recombinante, pour des études fonctionnelles de SUMO dans des cellules de mammifères fixes et des gonades de nématodes disséqué. KmUTAG-FL est un réactif spécifique au PAN-SUMO tolérant le stress qui reconnaît et piège les protéines conjuguées au SUMO et les chaînes de SUMO indigènes. Étant donné que la structure tertiaire de SUMO est très conservée, il est très probable que des variantes de SUMO issues de systèmes supplémentaires de …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous aimerions remercier tous les membres du laboratoire Kerscher pour leur soutien, Nathalie Nguyen pour la lecture critique du manuscrit, et Lidia EPP pour le séquençage. Ce travail a été appuyé par le Fonds de commercialisation de la recherche du Commonwealth MF16-034-LS à OK. Le soutien de la recherche pour les étudiants de W & M a été fourni par le fonds Bailey-Huston Research, et les bourses Charles Center Honors à RY et CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
Referanslar
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