Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular

Todos los protocolos de experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Tecnología de Illinois (Protocolo 2015-001, Fecha de aprobación: 3 de noviembre de 2015) y siguieron a la “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio”9 . 1. Preparación previa al experimento Preparar 500 ml de la solución de Ringer (contiene: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mM CaCl2, 10,0 mM HEPES, 11 mM de glucosa, pH 7,4) recién para cada día del experimento. Llene 200 ml de la solución de Ringer en una botella de spray y guárdela a 4 oC en nevera. Llene una placa Petri (10 cm de diámetro) con la solución de Ringer y perfundie con oxígeno 100% conectando el tubo de un cilindro de oxígeno a una piedra de aire del acuario. Los platos De Petri (“platos de disección”) fueron recubiertos previamente con un compuesto de elastómero para permitir la inserción de alfileres durante la disección. Prepare ganchos de montaje metálicos. Corte dos piezas de alambre de acero inoxidable, de 0,5 mm de diámetro, a la longitud adecuada y doble el alambre en ambos extremos para formar ganchos. Organice todas las herramientas de diselación, tijeras, fórceps de atablimiento de sutura, microtijeras a mano para su uso.NOTA: La parte del gancho debe ser de unos 3 mm de largo. El cable más largo (que termina en un gancho) debe ser de unos 5 cm de largo, y el alambre más corto (que también termina en un gancho) debe ser de aproximadamente 1 cm de largo para adaptarse a las cámaras personalizadas utilizadas en BioCAT y permitir un rango de movimiento suficiente para el brazo del transductor. Conecte y encienda todo el equipo. Esto incluye un motor/transductor de fuerza combinado, un controlador de transductor de motor/fuerza, un estimulador de corriente bifásica de alta potencia y un sistema de adquisición/control de datos controlado por computadora. Encienda el sistema de adquisición de datos y bistúrelo antes de iniciar el experimento10. Brevemente, calibrando la fuerza añadiendo un conjunto de pesos conocidos, cubriendo hasta el 50% de la fuerza máxima medida por el transductor de fuerza en una progresión lineal, en el transductor de fuerza y registrando los cambios de voltaje de salida. Calibrar la longitud aplicando un conjunto de voltaje de salida conocido al brazo de la palanca y medir el cambio de longitud del brazo. Conecte las mangueras del bloque térmico del soporte de la muestra a un baño circulante refrigerado y ajuste la temperatura para mantener la temperatura deseada en la cámara a entre 10 oC y 40 oC. Determine esto empíricamente con antelación ajustando el baño circulante a un rango de temperaturas y midiendo la temperatura en la cámara con un termopar. 2. Preparación muscular Eutanasia del ratón Eutanasia el ratón por inhalación de dióxido de carbono seguida de luxación cervical. Rocíe la piel de la extremidad posterior con la solución fría de Ringer para evitar que el cabello sople en la preparación. Retire la piel cortándola alrededor del muslo usando tijeras de disección fina y tire rápidamente de la piel hacia abajo usando #5 fórceps para exponer los músculos. Amputar la extremidad posterior y transferirla a una placa de disección que ha sido llena de solución de Ringer oxigenada, y luego colocar bajo un microscopio de disección binocular. Preparación de un músculo soleus Ancle la extremidad posterior hacia abajo en el plato de diseción con el músculo gastrocnemius hacia arriba. Corta el tendón distal del grupo muscular gastrocnemius/soleus y levanta los músculos suavemente y lentamente cortando la fascia a ambos lados del músculo gastrocnemius usando tijeras finas. Aísle el grupo muscular gastrocnemius/soleus de la extremidad después de liberar el tendón proximal del músculo soleus. Ancle el grupo muscular que contiene el músculo gastrocnemius y el tendón distal hacia abajo en la placa de diseción. Levante el músculo soleus suavemente a través del tendón proximal y sepárelo del músculo gastrocnemius dejando la mayor parte del tendón distal soleus intacto como sea posible. Preparación de un extensor digitorium longus (EDL) muscular Ancle la extremidad posterior hacia abajo en la placa de diseción con el músculo anterior tibialis hacia arriba. Corta la fascia a lo largo del músculo tibialis anterior (TA) y tira de ella con fórceps. Identificar y cortar el tendón distal del músculo TA. Levante el músculo TA y córtelo cuidadosamente sin tirar del músculo EDL. Cortar el lado lateral de la rodilla y exponer los dos tendones. Cortar el tendón proximal, dejando la mayor cantidad posible del tendón todavía unido al músculo, y levantar el músculo EDL (músculo medial) tirando suavemente del tendón. Corte el tendón distal una vez expuesto. Montaje del músculo Anclar el músculo a través de los tendones, y recortar toda la grasa extra, fascia y tendón de distancia tanto como sea posible. Inserte un tendón en un nudo preatado y ate la sutura firmemente con fórceps de sutura. Ate el segundo nudo alrededor del gancho de metal. Repita el mismo procedimiento con el gancho largo en el otro extremo del tendón. Asegúrese de que ninguno del cuerpo del músculo es contactado por las suturas. Esto dañará la preparación. Fije el gancho corto a la parte inferior de la cámara experimental y el gancho largo al transductor/motor de fuerza de modo dual. Burbuja la solución en la cámara experimental con 100% de oxígeno. Optimización de los protocolos de estimulación y la longitud muscular Estirar el músculo ajustando los micromanipuladores conectados al transductor/motor para generar una tensión basal entre 15 y 20 mN antes de encontrar los mejores parámetros de estímulo. Ajuste el voltaje de estimulación a 40 V. La corriente de estimulación aumenta sistemáticamente hasta que no hay un aumento adicional en la fuerza de contracción. La corriente más alta encontrada se incrementa en aproximadamente un 50% para garantizar la activación supra-máxima. Encuentra la longitud óptima, L0, definida como la longitud muscular que da la máxima fuerza de contracción, aumentando la longitud muscular y activando el músculo con una sola contracción hasta que la fuerza activa (fuerza máxima menos fuerza basal) deje de aumentar. Realice una contracción tetanica corta (activación de 1 s) para probar el montaje y estirar el músculo de nuevo a la fuerza basal óptima si es necesario. Registre la longitud muscular en mm con una pinza digital. 3. Difracción de rayos X NOTA: La siguiente descripción es para experimentos de difracción de rayos X realizados utilizando el instrumento de difracción de rayos X de ángulo pequeño en la línea de haz BioCAT 18ID en la Fuente Avanzada de Fotones, laboratorio nacional de Argonne, pero métodos similares podrían emplearse en otras líneas de haz como ID 02 en la ESRF (Francia) y BL40XU en SPring8 (Japón). Beamline 18ID se opera a una energía de haz de rayos X fija de 12 keV (0.1033 nm de longitud de onda) con un flujo incidente de 1013 fotones por segundo en el haz completo. Elija una muestra a la distancia del detector (longitud de la cámara). Utilice una longitud de cámara de 1,8 m para experimentos que examinen las reflexiones de miosina de 2,7 nm de actina y alto orden, como reflejos meridionales de 2,8 nm. Utilice una cámara de 4-6 m para otros experimentos, donde uno está principalmente interesado en detalles finos en el meridiano y las líneas de capa Optimización de la posición de la muestra en la viga Determine la posición del haz utilizando un trozo de papel sensible a los rayos X que produzca una mancha oscura en respuesta a los rayos X (“una quemadura”). A continuación, utilice un generador de video cruz para crear una cruz alineada con la marca de quemadura en el papel o simplemente haga una marca en la pantalla de video con un rotulador. Utilice la interfaz gráfica de usuario suministrada por BioCAT al posicionador de muestra para mover el músculo que se va a centrar en la posición del haz. Oscila la cámara de la muestra a 10-20 mm/s moviendo la etapa de la muestra para extender la dosis de rayos X sobre el músculo durante la exposición. Observe la muestra a medida que se mueve para evitar grandes regiones de fascia (contiene colágeno que contaminará los patrones de difracción) y para asegurarse de que permanece iluminada durante todo el camino de su recorrido.NOTA: Los pasos exactos requeridos en las secciones 3.3 y 3.4 para realizar los ajustes y acciones requeridos utilizando la interfaz gráfica de usuario suministrada por la línea de haz serán específicos de la línea de haz y del detector. Pregunte al personal de la línea de haz sobre cómo realizar estas operaciones. Configuración del detector CCD (dispositivo acoplado de carga) para patrones de alta resolución desde el músculo en estados estáticos definidos (descanso o durante la contracción isométrica) Configure el tiempo de exposición y el período de exposición en la interfaz gráfica de usuario con el software de control. Tome una imagen de fondo oscuro antes de tomar la exposición y repita este procedimiento cada 2 horas o después de cambiar el tiempo de exposición para corregir cualquier deriva en la electrónica de lectura del detector. Atenúe el haz de rayos X al valor deseado para la exposición. A continuación, tome una imagen. No es posible tomar secuencias de imágenes con este detector. El detector CCD también necesita varios segundos para leer una imagen individual. Configuración del detector de matriz de píxeles para un experimento resuelto en el tiempo Configure el número de imágenes, el tiempo de exposición y el período de exposición en la interfaz gráfica de usuario. El detector de matriz de píxeles utilizado aquí necesita al menos 1 ms para la lectura. La frecuencia máxima de fotogramas para el detector de recuento de fotones es de 500 Hz. Utilice la señal de salida del detector de recuento de fotones para controlar el obturador de rayos X. Atenúe el haz a la intensidad deseada. Armar el detector y esperar el disparador del sistema de adquisición de datos. Sincronice los datos mecánicos y de rayos X accionándolos al mismo tiempo. Los patrones de rayos X se recogen continuamente a lo largo del protocolo a con un tiempo de exposición de 1 ms y un período de exposición de 2 ms.NOTA: El tiempo exacto de exposición y el período de exposición deben determinarse caso por caso para la información deseada y la vida útil observada de la muestra en el haz. Atenúe el haz para no utilizar más haz de rayos X del necesario para proporcionar datos analizables en el período de exposición elegido. 4. Tratamiento muscular post-experimento Recuperar y sopesar el músculo después de cada experimento mecánico y de rayos X. Calcular el área transversal del músculo utilizando la longitud muscular medida y la masa muscular11 asumiendo una densidad muscular de 1,06 g/mL12. Estirar el músculo a la longitud experimental y fijar el músculo en 10% de formalina durante 10 min. Separar el músculo fijo en una serie de haces de fibra seleccionados de lugares a lo largo de toda la sección3de la cruz muscular. Mida la longitud del sarcomere utilizando un sistema de medición de longitud de sarcomere de vídeo.