Röntgendiffractie van intact Murine skeletspieren als een instrument voor het bestuderen van de structurele basis van spierziekte

Alle dier experimenten protocollen werden goedgekeurd door het Illinois Institute of Technology institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (protocol 2015-001, goedkeuringsdatum: 3 november 2015) en volgde de NIH “gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren”9 . 1. voorbereiding vooraf experiment Bereid 500 mL Ringer’s Solution (bevat: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mm CACL2, 10,0 mm Hepes, 11 mm glucose, pH 7,4) vers voor elke dag van het experiment. Vul 200 mL Ringer’s Solution in een spray fles en bewaar op een koelkast van 4 °C. Vul een Petri schaaltje (10 cm in diameter) met Ringer-oplossing en parfumeer met 100% zuurstof door de buis van een zuurstofcilinder aan te sluiten op een aquarium lucht steen. De Petri schalen (“dissecting dishes”) waren eerder bekleed met een elastomeer verbinding om pennen te kunnen inbrengen tijdens de dissectie. Maak metalen montage haken. Snijd twee stukken roestvrijstaal draad, 0,5 mm in diameter, naar de juiste lengte en buig de draad aan beide uiteinden om haken te vormen. Rangschik alle ontkoppelende gereedschappen, scharen, hecht bindmiddel Tang, micro-schaar handig voor gebruik.Opmerking: Het haak gedeelte moet ongeveer 3 mm lang zijn. De langere draad (eindigend in een haak) moet ongeveer 5 cm lang zijn, en de kortere draad (ook eindigend in een haak) moet ongeveer 1 cm lang zijn om te passen in de aangepaste kamers die worden gebruikt bij biocat en een voldoende bewegingsbereik voor de transducer arm mogelijk te maken. Verbind en zet alle apparatuur aan. Dit omvat een gecombineerde motor/kracht transducer, motor/kracht transducer controller een High-Power bi-phasic stroom stimulator, en een computergestuurde data-acquisitie/controlesysteem. Schakel het systeem voor gegevensverzameling in en Kalibreer het voordat u begint met het experiment10. Kort, het kalibreren van de kracht door het toevoegen van een set van bekende gewichten, die tot 50% van de maximale kracht gemeten door de kracht transducer in een lineaire progressie, op de kracht transducer en het vastleggen van de uitgangsspanning veranderingen. Kalibreer de lengte door een set bekende uitgangsspanning op de hefarm toe te passen en de lengte wisseling van de arm te meten. Sluit de slangen van het thermische blok op de monsterhouder aan op een koel Circulerend bad en stel de temperatuur in om de gewenste temperatuur in de kamer te behouden tot tussen 10 °C en 40 °C. Bepaal dit empirisch van tevoren door het circulerende bad in te stellen op een bereik van temperaturen en de temperatuur in de kamer te meten met een thermokoppel. 2. spier bereiding Euthanatatie van de muis Euthaniseer de muis door koolstofdioxide inademing, gevolgd door cervicale dislocatie. Spray de huid op het achterste ledemaat met Cold Ringer-oplossing om te voorkomen dat het haar in de voorbereiding waait. Verwijder de huid door het te snijden rond de dij met behulp van fijne dissectie schaar en trek de huid snel omlaag met behulp van #5 tang om de spieren bloot te leggen. Laat het achterste ledemaat amputeren en breng het over in een ontleed gerecht dat is gevuld met de oplossing van oxygenized Ringer en plaats het vervolgens onder een verrekijker ontleed Microscoop. Het bereiden van een soleus spier Speld de achterste ledemaat in de ontsnij schotel met de gastrocnemius-spier naar boven. Snijd de distale pees van de gastrocnemius/soleus muscle Group en til de spieren zachtjes en langzaam op door de fascia aan weerszijden van de gastrocnemius-spier weg te knippen met behulp van een fijne schaar. Isoleer de gastrocnemius/soleus muscle Group van de ledemaat na het vrijmaken van de proximale pees van de soleus spier. Speld de spiergroep met de gastrocnemius-spier en de distale pees naar beneden in de ontleden Dish. Til de soleus-spier zachtjes op via de proximale pees en scheid deze van de gastrocnemius-spier en laat zo veel mogelijk van de soleus distale pees intact. Voorbereiding van een extensor digitorium Longus (EDL) spier Speld de achterste ledemaat in de ontleden Dish met de tibialis anterieure spier naar boven. Snijd de fascia langs de tibialis voorste (TA) spier en trek het duidelijk met behulp van een tang. Identificeer en snijd de distale pees van de TA-spier. Til de TA-spier op en snijd deze voorzichtig uit zonder aan de EDL-spier te trekken. Snijd de laterale zijde van de knie open en stel de twee pezen bloot. Snijd de proximale pees, verlaten zo veel van de pees mogelijk nog steeds gehecht aan de spier, en til de EDL spier (mediale spier) door zachtjes trekken de pees. Snijd de distale pees nadat deze is blootgesteld. De spier monteren Speld de spier via de pezen, en trim alle extra vet, fascia en pees weg zo veel mogelijk. Steek een pees in een vooraf gebonden knoop en bind de hecht goed met hechtdraad BIND Tang. Bind de tweede knoop rond de metalen haak. Herhaal dezelfde procedure met de lange haak aan de andere kant van de pees. Zorg ervoor dat geen van de body van de spier wordt benaderd door de hechtingen. Dit zal het preparaat beschadigen. Bevestig de korte haak aan de onderkant van de experimentele kamer en de lange haak aan de dual-mode kracht transducer/motor. Bel de oplossing in de experimentele kamer met 100% zuurstof. Optimaliseren van stimulatie protocollen en spier lengte Strek de spier door het aanpassen van de micro manipulatoren bevestigd aan de transducer/motor om een baseline spanning te genereren tussen 15 aan 20 mN voor het vinden van de beste stimulus parameters. Stel de stimulatie spanning in op 40 V. De stimulatie stroom wordt systematisch verhoogd tot er geen extra toename in twitch-kracht is. De hoogste stroom die wordt gevonden, wordt met ongeveer 50% verhoogd om een supra-maximale activering te garanderen. Vind de optimale lengte, L0, gedefinieerd als de spier lengte die maximale twitch kracht geven, door het verhogen van de spier lengte en het activeren van de spier met een enkele twitch totdat de actieve kracht (piekkracht minus Baseline kracht) stopt met verhogen. Voer een korte tetanic contractie (1 s activering) om de montage te testen en strek de spier terug naar optimale basislijn kracht indien nodig. Noteer de spier lengte in mm met een digitale remklauw. 3. röntgendiffractie Opmerking: De volgende beschrijving is voor röntgendiffractie-experimenten uitgevoerd met behulp van het kleine hoek röntgendiffractie-instrument op de biocat beamline 18id bij de Advanced photon source, het Argonne National Laboratory maar vergelijkbare methoden kunnen worden gebruikt op andere lijnen zoals ID 02 bij het ESRF (Frankrijk) en BL40XU op SPring8 (Japan). Beamline 18ID wordt bediend met een vaste X-Ray Beam-energie van 12 keV (0,1033 nm golflengte) met een incident flux van ~ 1013 fotonen per seconde in de volle straal. Kies een preparaat naar detector afstand (camera lengte). Gebruik een 1,8 m camera lengte voor experimenten met de 2,7 nm actine en High-order myosin reflecties zoals 2,8 nm Meridionale reflecties. Gebruik een 4-6 m camera voor andere experimenten, waarbij men primair geïnteresseerd is in fijn detail op de meridiaan en laag lijnen Het optimaliseren van de positie van het monster in Beam Bepaal de stralings positie met behulp van een stukje Röntgen gevoelig papier dat een donkere vlek produceert als reactie op röntgenstralen (“een brandwond”). Gebruik vervolgens een video cross-Hair generator om een kruis haar te maken dat is uitgelijnd met de brand markering op het papier of maak gewoon een markering op het videoscherm met een marker pen. Gebruik de BioCAT meegeleverde grafische gebruikersinterface van de sample Positioner om de spier te bewegen om gecentreerd te worden op de stralings positie. Oscilleren de bemonsterings kamer bij ~ 10-20 mm/s door de monster fase te bewegen om de Röntgen dosis over de spier te spreiden tijdens de blootstelling. Observeer het monster terwijl het beweegt om grote gebieden van fascia te vermijden (bevat collageen dat de diffractie patronen zal vervuilen) en om ervoor te zorgen dat het tijdens het hele traject van zijn reis verlicht blijft.Opmerking: De exacte stappen die nodig zijn in de paragrafen 3,3 en 3,4 om de vereiste instellingen en acties te maken met behulp van de door beamline geleverde grafische gebruikersinterface, zijn beamline en detector specifiek. Vraag beamline-medewerkers hoe u deze bewerkingen uitvoeren. Het instellen van de CCD (opladen gekoppeld apparaat) detector voor hoge resolutie patronen van spier in gedefinieerde statische toestanden (rusten, of tijdens isometrische contractie) Stel de belichtingstijd en belichtingsperiode in de grafische gebruikersinterface in op de besturingssoftware. Neem een donkere achtergrondafbeelding voordat u de belichting inneemt en herhaal deze procedure om de 2 uur of na het wijzigen van de belichtingstijd om eventuele drift in de uitlezen elektronica van de melder te corrigeren. De X-Ray-straal naar de gewenste waarde voor de belichting verzachten. Neem dan een foto. Het is niet mogelijk om sequenties van beelden te nemen met deze detector. De CCD-detector heeft ook enkele seconden nodig om een individueel beeld te lezen. De pixel array-detector instellen voor een tijd opgelost experiment Stel het aantal afbeeldingen, belichtingstijd, belichtingsperiode in de grafische gebruikersinterface in. De pixel array detector die hier wordt gebruikt, moet minimaal 1 MS uitlezen. De maximale framefrequentie voor foon teldetector is 500 Hz. gebruik het uitgangssignaal van de foton teldetector om de X-Ray sluiter te bedienen. De straal naar de gewenste intensiteit verzwakken. Arm de detector en wacht tot de trigger van het data-acquisitie systeem. Synchroniseer de mechanische en Röntgen gegevens door ze op hetzelfde moment te activeren. De Röntgen patronen worden continu verzameld gedurende het protocol a met een belichtingstijd van 1 MS en een blootstellingsperiode van 2 MS.Opmerking: De exacte blootstellingstijd en blootstellingsperiode moeten per geval worden bepaald voor de gewenste informatie en de waargenomen levensduur van het monster in de straal. De straal te verzachten om niet meer röntgenstraal te gebruiken dan nodig is om analyseerbaar gegevens te leveren in de gekozen blootstellingsperiode. 4. post-experiment spier behandeling Herstel en weeg de spier na elk mechanisch en Röntgen experiment. Bereken het dwarsdoorsnede gebied van de spier met behulp van de gemeten spier lengte en de spier massa11 uitgaande van een spier dichtheid van 1,06 g/ml12. Strek de spier tot de experimentele lengte en bevestig de spier in 10% formaline 10 min. Scheid de vaste spier in een reeks van vezelbundels geselecteerd uit locaties over de gehele spier doorsnede3. Meet de sarcomere lengte met behulp van een video sarcomere lengte meetsysteem.