Génotypage de l'anémone de mer pendant le développement précoce

Les Cnidariens représentent un groupe diversifié d’animaux qui comprennent les méduses, les coraux et les anémones de mer. Ce sont des diploblastes, composés d’ectoderm et d’endoderm qui sont séparés par une matrice extracellulaire (mesoglea). Cnidaria est un groupe sœur pour spécifier Bilateria, à laquelle les modèles animaux traditionnels tels que Drosophila et Mus appartiennent¹. En outre, on pense que la divergence Cnidaria-Bilateria s’est produite dans la période précambrienne². En tant que tel, les études comparatives des cnidaires et des bilateriens sont essentielles pour obtenir des perspicacités dans la biologie de leur ancêtre commun le plus récent. Récemment, la génomique comparative a révélé que les cnidaires et les bilateriens partagent de nombreux gènes de boîte à outils de développement tels que l’encoche et la bHLH, ce qui implique que leur ancêtre commun avait déjà ces gènes³. Cependant, le rôle de ces gènes de boîte à outils développementales dans le dernier ancêtre commun de Cnidaria et De Bilateria est comparativement moins bien compris. Pour résoudre ce problème, il est essentiel d’étudier comment ces gènes profondément conservés fonctionnent chez les cnidaires.

L’un des nouveaux modèles génétiques cnidaires est l’anthozoan Nematostella vectensis. Son génome a été séquencé³, et une variété d’outils génétiques, y compris le knockdown de gène morpholino-négocié, la transgenèse meganuclease-négociée, et LES knockins et knockouts de gène CRISPR-Cas9-négociés, sont maintenant disponibles pour l’usage dans cet animal. En outre, le développement de Nematostella est relativement bien compris. Pendant l’embryogenèse, la gastrulation se produit par invagination⁴, et l’embryon se développe en une larve de planula de nage libre. La planule se transforme ensuite en polype sessile avec une bouche et des tentacules circonraux. Le polype grandit alors et atteint la maturité sexuelle.

CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis ciblé est maintenant couramment utilisé pour étudier la fonction génique dans Nematostella vectensis^5,6,7,8,9. Pour générer des mutants knock-out dans Nematostella, un cocktail contenant locus-spécifique RNA mono-guide et la protéine Cas9 endodocléuale est d’abord injecté dans les œufs non fécondés ou fécondés pour produire des animaux fondateurs F0 qui montrent généralement mosaïsme. Les animaux F0 sont ensuite élevés à maturité sexuelle et croisés les uns avec les autres pour produire une population de F1, dont un sous-ensemble peut être ko en état de mutation⁶. Alternativement, les animaux F0 sexuellement matures peuvent être croisés avec des animaux de type sauvage pour générer des animaux hétérozygotes F1, et les hétérozygotes F1 qui portent un allèle knock-out dans le lieu d’intérêt peuvent alors être croisés les uns avec les autres pour produire la progéniture F2, un quart dont on s’attend à ce qu’il s’agit de mutants knock-out⁵. Les deux approches nécessitent une méthode pour identifier les mutants knock-out d’une population génétiquement hétérogène. Les tentacules de polype peuvent être employéspour extraire l’ADN génomique pour le génotypage 6,⁷. Cependant, dans les cas où la fonction développementale du gène d’intérêt est étudiée et où les embryons mutants n’atteignent pas le stade du polype (c.-à-d. en raison de la létalité larvaire associée à la mutation), les mutants knock-out doivent être identifiés tôt dans l’ontogéne. Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotyper des animaux individuels au stade de gastrula sans sacrifier l’animal, qui permet d’identifier des mutants knock-out d’une population génétiquement hétérogène d’embryons. La durée de l’ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d’embryons à dépister, mais il nécessite un minimum de 4-5 h.