Генотипирование морского анемона во время раннего развития

Книдарийцы представляют разнообразную группу животных, которые включают медуз, кораллов и морских анемонов. Это дипобласты, состоящие из эктодерма и эндодерма, которые разделены внеклеточной матрицей (мезоглией). Cnidaria является сестрой группы для speciose Bilateria, к которому традиционные модели животных, таких как Drosophila и Mus принадлежат¹. Кроме того, Cnidaria-Bilateria расхождения, как полагают, имели место в докембрийский период². Таким образом, сравнительные исследования книдарян и двулатерян имеют важное значение для получения понимания биологии их последнего общего предка. Недавно сравнительная геномика показала, что книдарианцы и двулатеры имеют много генов инструментария развития, таких как выемка и bHLH, подразумевая, что их общий предок уже имел эти гены³. Тем не менее, роль этих генов инструментария развития в последнем общем предке Cnidaria и Bilateria сравнительно менее хорошо понимается. Для решения этой проблемы, очень важно изучить, как эти глубоко сохраненные гены функционируют в книдарии.

Одной из новых книдарских генетических моделей является anthozoan Nematostella vectensis. Его геном был секвенирован³, и различные генетические инструменты, в том числе морфолино-опосредованный ген нокдаун, мегануклеазы опосредованного трансгенеза, и CRISPR-Cas9-опосредованные генные стукины и нокауты, теперь доступны для использования в этом животном. Кроме того, развитие Nematostella относительно хорошо понимается. Во время эмбриогенеза, гастрирование происходит путем инвагинации⁴, и эмбрион превращается в личинку планулы свободного плавания. Планула впоследствии превращается в полип с ессиальным полипом с ртом и околоустными щупальцами. Затем полип растет и достигает половой зрелости.

CRISPR-Cas9-опосредованный целевой мутагенез в настоящее время регулярно используется для изучения функции генов в Nematostella vectensis^5,6,7,8,9. Для генерации нокаут мутантов в Nematostella, коктейль, содержащий локус конкретных одного руководства РНК и эндонуклеазы Cas9 белка впервые вводится в неоплодотворенных или оплодотворенных яиц для производства F0 основателя животных, которые обычно показывают, мозаикизма. F0 животных впоследствии подняли до половой зрелости и пересеклись друг с другом, чтобы произвести F1 населения, подмножество которых может быть нокаут мутантов⁶. Кроме того, сексуально зрелые животные F0 могут быть скрещены с дикими животными типа для создания F1 гетерозиготных животных, и F1 гетерозиготы, которые несут нокаут аллель в локус интереса могут быть пересечены друг с другом для производства F2 потомство, одна четверть из которых, как ожидается, будет нокаут мутантов⁵. Оба подхода требуют метода выявления нокаут-мутантов из генетически неоднородной популяции. Полипщу можно использовать для извлечения геномной ДНКдля генотипирования 6,⁷. Однако в тех случаях, когда исследуется функция развития гена интереса и эмбрионы-мутанты не достигают стадии полипа (т.е. из-за личинок летальности, связанной с мутацией), мутации мутантов необходимо выявить на ранних стадиях онтогена. Описано здесь ПЦР-протокол генотипа отдельных животных на стадии гаструлы без ущерба для животного, который позволяет идентифицировать нокаутмутантов из генетически неоднородной популяции эмбрионов. Продолжительность всего процесса генотипирования зависит от количества эмбрионов, которые должны быть обследованы, но это минимально требует 4-5 ч.