Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung

Die Cnidarians repräsentieren eine vielfältige Gruppe von Tieren, die Quallen, Korallen und Seeanemonen umfassen. Es handelt sich um Diploblasten, die aus Ektoderm und Endoderm bestehen und durch eine extrazelluläre Matrix (Mesoglea) getrennt sind. Cnidaria ist eine Schwestergruppe zur Speziiose Bilateria, zu der traditionelle Tiermodelle wie Drosophila und Mus gehören¹. Zusätzlich wird angenommen, dass die Divergenz Cnidaria-Bilateria in der vorkambrischen Periode²aufgetreten ist. Als solche sind vergleichende Studien an Cnidarians und Bilaterianern unerlässlich, um Einblicke in die Biologie ihres jüngsten gemeinsamen Vorfahren zu gewinnen. Kürzlich hat die vergleichende Genomik gezeigt, dass Cnidarians und Bilaterianer viele Entwicklungs-Toolkit-Gene wie Kerb und bHLH teilen, was impliziert, dass ihr gemeinsamer Vorfahrbereitsen diese Gene hatte³. Die Rolle dieser Entwicklungs-Toolkit-Gene im letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria ist jedoch vergleichsweise weniger gut verstanden. Um dieses Problem anzugehen, ist es wichtig zu untersuchen, wie diese tief konservierten Gene bei Cnidarians funktionieren.

Eines der aufkommenden cnidarian genetischen Modelle ist die anthozoanE Nematostella vectensis. Sein Genom wurde³sequenziert, und eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen, einschließlich Morpholino-vermittelter Genknockdown, Meganuklease-vermittelte Transgenese und CRISPR-Cas9-vermittelte Genknockins und Knockouts, sind jetzt für den Einsatz in diesem Tier verfügbar. Darüber hinaus ist die Nematostella-Entwicklung relativ gut verstanden. Während der Embryogenese tritt die Gastrulation durch Invagination⁴auf und der Embryo entwickelt sich zu einer freischwimmenden Planulalarve. Die Planula verwandelt sich anschließend in einen sessilen Polypen mit Mund und umlaufenden Tentakeln. Der Polypen wächst dann und erreicht die Geschlechtsreife.

CRISPR-Cas9-vermittelte gezielte Mutagenese wird jetzt routinemäßig verwendet, um die Genfunktion in Nematostella vectensis^5,6,7,8,9zu untersuchen. Zur Erzeugung von Knockout-Mutanten in Nematostellawird ein Cocktail mit lokusspezifischen Ein-Guide-RNAs und dem Endonuklease-Cas9-Protein zunächst in unbefruchtete oder befruchtete Eier injiziert, um F0-Gründertiere zu produzieren, die typischerweise Mosaik. F0-Tiere werden anschließend zur Geschlechtsreife erhoben und miteinander gekreuzt, um eine F1-Population zu erzeugen, von denen eine Teilmenge Knockout-Mutanten⁶sein kann. Alternativ können geschlechtsreife F0-Tiere mit Wildtieren gekreuzt werden, um F1-Heterozygoten zu erzeugen, und F1-Heterozygoten, die ein Knockout-Allel im Ort des Interesses tragen, können dann miteinander gekreuzt werden, um F2-Nachkommen zu produzieren, ein Viertel von denen erwartet werden, knockout mutants⁵sein. Beide Ansätze erfordern eine Methode zur Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population. Polyp Tentakel können verwendet werden, um genomische DNA für genotypisieren^6,7zu extrahieren. In Fällen, in denen die Entwicklungsfunktion des Gens untersucht wird und mutierte Embryonen das Polypenstadium nicht erreichen (d. h. aufgrund der mit der Mutation verbundenen Larventoalität), müssen Knockout-Mutanten früh in der Ontogenidentifizierten identifiziert werden. Hier wird ein PCR-basiertes Protokoll beschrieben, um einzelne Tiere im Gastrulastadium zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern, was die Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen ermöglicht. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gesiebenden Embryonen ab, erfordert aber minimal 4-5 h.