Özet

Génotypage de l'anémone de mer pendant le développement précoce

Published: May 13, 2019
doi:

Özet

Le but de ce protocole est de génotype de l’anémone de mer Nematostella vectensis pendant la gastrulation sans sacrifier l’embryon.

Abstract

Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotype l’embryon de stade de gastrula du vectensis cnidaire anthozoan nematostella sans sacrifier la vie de l’animal. Après la fécondation in vitro et la dégelée, les zygotes sont autorisés à se développer pendant 24 h à température ambiante pour atteindre le stade précoce à moyen-gastrula. Les embryons de gastrula sont ensuite placés sur un lit de gel d’agarose dans un plat Petri contenant de l’eau de mer. Sous le microscope disséquant, une aiguille de tungstène est utilisée pour séparer chirurgicalement un fragment de tissu aboral de chaque embryon. Les embryons post-chirurgical sont ensuite autorisés à guérir et à poursuivre leur développement. L’ADN génomique est extrait du fragment de tissu isolé et utilisé comme modèle pour le PCR spécifique au locus. Le génotype peut être déterminé en fonction de la taille des produits PCR ou de la présence ou de l’absence de produits PCR spécifiques à l’allèle. Les embryons post-chirurgical sont ensuite triés en fonction du génotype. La durée de l’ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d’embryons à dépister, mais il faut au minimum 4 à 5 h. Cette méthode peut être utilisée pour identifier les mutants knock-out d’une population génétiquement hétérogène d’embryons et permet d’analyser les phénotypes au cours du développement.

Introduction

Les Cnidariens représentent un groupe diversifié d’animaux qui comprennent les méduses, les coraux et les anémones de mer. Ce sont des diploblastes, composés d’ectoderm et d’endoderm qui sont séparés par une matrice extracellulaire (mesoglea). Cnidaria est un groupe sœur pour spécifier Bilateria, à laquelle les modèles animaux traditionnels tels que Drosophila et Mus appartiennent1. En outre, on pense que la divergence Cnidaria-Bilateria s’est produite dans la période précambrienne2. En tant que tel, les études comparatives des cnidaires et des bilateriens sont essentielles pour obtenir des perspicacités dans la biologie de leur ancêtre commun le plus récent. Récemment, la génomique comparative a révélé que les cnidaires et les bilateriens partagent de nombreux gènes de boîte à outils de développement tels que l’encoche et la bHLH, ce qui implique que leur ancêtre commun avait déjà ces gènes3. Cependant, le rôle de ces gènes de boîte à outils développementales dans le dernier ancêtre commun de Cnidaria et De Bilateria est comparativement moins bien compris. Pour résoudre ce problème, il est essentiel d’étudier comment ces gènes profondément conservés fonctionnent chez les cnidaires.

L’un des nouveaux modèles génétiques cnidaires est l’anthozoan Nematostella vectensis. Son génome a été séquencé3, et une variété d’outils génétiques, y compris le knockdown de gène morpholino-négocié, la transgenèse meganuclease-négociée, et LES knockins et knockouts de gène CRISPR-Cas9-négociés, sont maintenant disponibles pour l’usage dans cet animal. En outre, le développement de Nematostella est relativement bien compris. Pendant l’embryogenèse, la gastrulation se produit par invagination4, et l’embryon se développe en une larve de planula de nage libre. La planule se transforme ensuite en polype sessile avec une bouche et des tentacules circonraux. Le polype grandit alors et atteint la maturité sexuelle.

CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis ciblé est maintenant couramment utilisé pour étudier la fonction génique dans Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Pour générer des mutants knock-out dans Nematostella, un cocktail contenant locus-spécifique RNA mono-guide et la protéine Cas9 endodocléuale est d’abord injecté dans les œufs non fécondés ou fécondés pour produire des animaux fondateurs F0 qui montrent généralement mosaïsme. Les animaux F0 sont ensuite élevés à maturité sexuelle et croisés les uns avec les autres pour produire une population de F1, dont un sous-ensemble peut être ko en état de mutation6. Alternativement, les animaux F0 sexuellement matures peuvent être croisés avec des animaux de type sauvage pour générer des animaux hétérozygotes F1, et les hétérozygotes F1 qui portent un allèle knock-out dans le lieu d’intérêt peuvent alors être croisés les uns avec les autres pour produire la progéniture F2, un quart dont on s’attend à ce qu’il s’agit de mutants knock-out5. Les deux approches nécessitent une méthode pour identifier les mutants knock-out d’une population génétiquement hétérogène. Les tentacules de polype peuvent être employéspour extraire l’ADN génomique pour le génotypage 6,7. Cependant, dans les cas où la fonction développementale du gène d’intérêt est étudiée et où les embryons mutants n’atteignent pas le stade du polype (c.-à-d. en raison de la létalité larvaire associée à la mutation), les mutants knock-out doivent être identifiés tôt dans l’ontogéne. Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotyper des animaux individuels au stade de gastrula sans sacrifier l’animal, qui permet d’identifier des mutants knock-out d’une population génétiquement hétérogène d’embryons. La durée de l’ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d’embryons à dépister, mais il nécessite un minimum de 4-5 h.

Protocol

1. Induction du frai, de la fécondation in vitro et de la dégelée Maintenir Nematostella vectensis dans l’eau de mer avec une salinité de 12 parties par millier (ppt) dans l’obscurité à 16 oC, alimentant Artemia tous les jours. La veille de l’induction du frai, placez les animaux dans un incubateur à température et à lumière. Programmez l’incubateur de sorte que les animaux soient exposés à 8 h de lumière à 25 oC. Facultatif : Nourrissez un petit morceau</…

Representative Results

Le génome de Nematostella a un locus unique qui code une protéine précurseur pour le gLWamide neuropeptide. Trois alleles mutants knock-out à ce locus (glw-a, glw-b, et glw-c) ont été précédemment signalés5. Quatre mâles hétérozygotes portant un allèle de type sauvage (en) et allèle à élimination bée-c-cau locus gLWamide (génotype : ‘ ‘ ”’ ‘ ‘ ‘ ‘ …

Discussion

Décrit ici un protocole basé sur PCR pour génotyper un seul embryon d’anémone de mer sans sacrifier l’animal. Après le frai et la dégelée, les œufs fécondés sont autorisés à se développer en gastrulae. La région aboral de chaque embryon de gastrula est enlevée chirurgicalement, et le tissu aboral isolé est employé pour l’extraction génomique suivante d’ADN, tandis que les embryons post-chirurgicaux restants guérissent et continuent le développement. Les extraits de gDNA sont ensuite utilisés pour un …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les critiques anonymes pour les commentaires sur la version antérieure du manuscrit, qui a amélioré le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Université de l’Arkansas.

Materials

Drosophila Peltier Refrigerated Incubator Shellab SRI6PF Used for spawning induction
Instant ocean sea salt Instant ocean 138510
Brine shrimp cysts Aquatic Eco-Systems, Inc. BS90
L-Cysteine Hydrochloride Sigma Aldrich C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500 VWR 89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0 QUALITY BIOLOGICAL 351-007-01
Potassium chloride VWR BDH9258
EDTA, 0.5M pH8 VWR BDH7830-1
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
Nonidet-P40 Substitute US Biological N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade ThermoFisher 25530049
Agarose VWR 710
Micro Dissecting needle holder Roboz RS-6060
Tungsten dissecting needle Roboz RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers Eppendorf E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England BioLabs M0530L
dNTP mix New England BioLabs N0447L
GLWamide universal forward primer 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Silva, M. A., Nakanishi, N. Genotyping of Sea Anemone during Early Development. J. Vis. Exp. (147), e59541, doi:10.3791/59541 (2019).

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