Dit protocol beschrijft een in vitro batch cultuur fermentatiesysteem van menselijke fecale microbiota, met behulp van inuline (een bekende prebiotisch en een van de meest bestudeerde microbiota modulatoren) om het gebruik van dit systeem te demonstreren bij het inschatten van de effecten van specifieke interventies op fecale microbiota samenstelling en metabole activiteiten.
De opkomende rol van het microbioom van de darmen bij verschillende menselijke ziekten vereist een doorbraak van nieuwe instrumenten, technieken en technologieën. Dergelijke verbeteringen zijn nodig om te ontcijferen van het gebruik van microbiome modulatoren voor voordelen voor de menselijke gezondheid. Echter, de grootschalige screening en optimalisatie van modulatoren om te valideren microbiome modulatie en voorspel gerelateerde gezondheidsvoordelen kunnen praktisch moeilijk zijn als gevolg van de noodzaak voor een groot aantal dieren en/of menselijke proefpersonen. Hiertoe kunnen in vitro-of ex vivo-modellen een voorafgaande screening van microbiome-modulatoren vergemakkelijken. Hierin, het is geoptimaliseerd en aangetoond een ex vivo fecale microbiota cultuur systeem dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van verschillende interventies van gut microbiome modulatoren met inbegrip van probiotica, prebiotica en andere voedselingrediënten, afgezien van nutraceuticals en drugs, over de diversiteit en samenstelling van de menselijke gut microbiota. Inuline, een van de meest bestudeerde prebiotische verbindingen en microbiome modulatoren, wordt gebruikt als een voorbeeld hier te onderzoeken van het effect ervan op de gezonde fecale microbiota samenstelling en de metabole activiteiten, zoals fecale pH en de fecale niveaus van organische zuren met inbegrip van lactaat en korte-keten vetzuren (SCFAs). Het protocol kan nuttig zijn voor studies die gericht zijn op het inschatten van de effecten van verschillende interventies van modulatoren op fecale microbiota-profielen en op het voorspellen van hun gevolgen voor de gezondheid.
De humane microbiota is een complexe Gemeenschap bestaande uit bacteriën, Archaea, virussen en eukaryotische microben1, die het menselijk lichaam zowel intern als extern bewonen. Recente bewijzen hebben de fundamentele rol van de darm microbiota en het darm-microbiome (de gehele verzameling van microben en hun genen gevonden in het menselijk maagdarmkanaal) vastgesteld in verschillende menselijke ziekten, waaronder obesitas, diabetes, hart-en vaatziekten, en kanker1,2,3. Bovendien produceren de micro-organismen die in onze darmen leven een breed spectrum van metabolieten die een aanzienlijke invloed hebben op onze gezondheid en kunnen ook bijdragen aan de pathofysiologie van verschillende ziekten, evenals een verscheidenheid aan metabole functies4, 5. abnormale veranderingen (verstoringen) in de samenstelling en functie van deze darm microbiële populatie worden over het algemeen aangeduid als “gut dysbiosis”. Dysbiosis wordt meestal geassocieerd met een ongezonde toestand van de gastheer en kan dus worden onderscheiden van de normale (homeostatische) microbiële Gemeenschap die is gekoppeld aan een gezonde controle staat van de gastheer. Specifieke patronen van gut microbiome dysbiosis worden vaak gevonden in verschillende ziekten1,2,3,6,7.
De fermentatie van onverteerd voedsel, in het bijzonder de fermenteerbare koolhydraten/vezels, door de darm microbiota levert niet alleen energie op, maar produceert ook afwijkende metabolieten, waaronder korte-keten vetzuren (SCFAs), lactaat, formaat, koolstofdioxide, methaan, waterstof en ethanol6. Bovendien, de darm microbiota produceert ook een aantal andere bioactieve stoffen zoals folaat, biotine, trimethylamine-N-oxide, serotonine, tryptofaan, Gamma-aminoboterzuur, dopamine, noradrenaline, acetylcholine, histamine, deoxycholzuur en 4-ethylfenylsulfaat. Dit gebeurt voornamelijk door het gebruik van intrinsieke metabole fluxen binnen de host-microbe niche, die bijdraagt aan verschillende lichaamsprocessen, metabole functies en epigenetische veranderingen1,8,9, 10. De effecten van verschillende interventies op dergelijke microbiële producten blijven echter onkown of onduidelijk vanwege het ontbreken van eenvoudige, efficiënte en reproduceerbare protocollen. De humane gut microbiota samenstelling is een extreem complex en divers ecosysteem, en daarom blijven veel vragen over haar rol in de menselijke gezondheid en ziekte pathologie nog steeds onbeantwoord. De effecten van vele gemeenschappelijke gut microbiome modulatoren (bv., probiotica, prebiotica, antibiotica, fecale transplantatie en infecties) op de samenstelling en metabole functies van de intestinale microbiota blijven grotendeels ongrijpbaar. Bovendien is het onderzoek en de validering van deze effecten in vivo moeilijk, vooral omdat de meeste nutriënten en metabolieten die door de darm microbiota worden geproduceerd, gelijktijdig en snel in de darmen worden geabsorbeerd of afgevoerd; Daarom blijft het meten van de productie, de hoeveelheid en de verwerking van deze metabolieten (bijv. SCFAs) in vivo nog steeds een praktische uitdaging. Inderdaad, fysiologische modellen zoals dieren en menselijke proefpersonen zijn van cruciaal belang voor het bepalen van de rol van gut microbiome en de modulatie ervan op gastheer gezondheid, maar deze mogelijk niet geschikt voor grootschalige screening van verschillende soorten microbiome modulatoren als gevolg van ethische, monetaire of tijdsbeperkingen. Hiertoe kunnen in vitro en/of ex vivo-modellen, zoals het kweken van gut microbiota in vitro en vervolgens interveniëren met verschillende microbiota-modulatoren, tijd-en geldbesparings mogelijkheden bieden en kunnen daarom voorlopige of grootschalige screening van verschillende componenten (zoals probiotica, prebiotica, en andere Interventionele verbindingen) om te onderzoeken/voorspellen hun effecten op de fecale microbiota diversiteit, samenstelling en metabole profielen. Studies met behulp van dergelijke in vitro en ex vivo systemen van het microbioom van de darmen kunnen meer inzicht in de interacties van gastheer-microbiome die bijdragen tot gastheer gezondheid en ziekte te vergemakkelijken, en kan ook leiden tot het vinden van nieuwe therapieën die gericht zijn op de microbiome te verbetering van de gezondheid van de gastheer en voorkomen en behandelen van verschillende ziekten1.
Hoewel de in vitro gut microbiota cultuur systemen niet echt de werkelijke intestinale omstandigheden kunnen repliceren, hebben verschillende laboratoria getracht dergelijke modellen te ontwikkelen, waarvan sommige tot op zekere hoogte uitvoerbaar zijn bevonden en met succes zijn gebruikt voor verschillende doeleinden. Een van de recente gut modellen is de Simulator van de menselijke intestinale microbiële ecosysteem, die het hele menselijke maagdarmkanaal nabootst, met inbegrip van de maag, dunne darm, en verschillende gebieden van de dikke darm. Dergelijke technisch complexe modellen zijn echter mogelijk niet toegankelijk voor andere onderzoeksfaciliteiten wereldwijd. Daarom is er nog steeds een kritische behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe alternatieve modellen die relatief eenvoudig, betaalbaar en praktisch zijn voor laboratoria die de microbiome modulatoren bestuderen en hun effecten op gut microbiota en host Health. Daarom zou het gebruik van een in vitro (of ex vivo) fecaal microbiota-cultuur systeem nuttig zijn voor het bestuderen van de effecten van dergelijke interventies11,12. Specifiek, het effect van verschillende prebiotica op de microbiota fermentatie capaciteit in termen van periodieke veranderingen in de darm microbiota diversiteit en samenstelling, de fecale pH, en de niveaus van microbiële metabolieten, met inbegrip van SCFAs en lactaat kan worden bestudeerd 13. hierin wordt, met behulp van inuline (een van de meest bestudeerde prebiotische componenten) als voorbeeld van de microbiome modulator, een stapsgewijs Protocol van dit eenvoudige ex vivo microbiota batch-cultuur systeem beschreven om het gebruik ervan aan te tonen om de veranderingen in de fecale microbiota en microbiële metabolieten na interventie met de microbiome modulatoren.
De in vitro fecale slurry fermentatie model hier gepresenteerd is een eenvoudige single-batch model om de effecten van verschillende substraten en microbiële stammen (bijvoorbeeld prebiotica en probiotica) op de samenstelling van menselijke fecale microbiota evenals haar metabole activiteiten in termen van fecale pH en SCFAs niveaus. De hierin gepresenteerde resultaten tonen aan dat de inoculatie van inuline de fecale pH vermindert en de niveaus van SCFAs en lactaat in inuline behandelde fecale specimen aanzienlijk verh…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs geven dankbaar steun aan de financiering van het centrum voor diabetes, obesitas en metabolisme en het klinisch en translationeel wetenschapscentrum, de Wake Forest School of Medicine, het ministerie van defensie financiering (subsidie nummer: W81XWH-18-1-0118), de Kermit Glenn Phillips II stoel in cardiovasculaire geneeskunde; de National Institutes of Health gefinancierd Claude D. Pepper oudere Amerikanen Center (gefinancierd door P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 en het klinisch en translationeel wetenschapscentrum (Clinical Research Unit, gefinancierd door UL1TR001420), wordt ook gelukkig erkend. We bedanken ook de vrijwilligers voor het verstrekken van fecale monsters, en onze andere Lab leden voor hun technische helpt tijdens dit experiment.
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
0.22 µm membrane filter | |||
AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
Bottle filter | Corning | ||
Cheesecloth | |||
Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
pH meter | |||
Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
Vortex | Thermoscientific | ||
Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |