Özet

Un modello di coltura batch in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano

Published: July 31, 2019
doi:

Özet

Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l’inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l’uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.

Abstract

Il ruolo emergente del microbioma intestinale in diverse malattie umane richiede una svolta di nuovi strumenti, tecniche e tecnologie. Tali miglioramenti sono necessari per decifrare l’utilizzo dei modulatori del microbioma per i benefici per la salute umana. Tuttavia, lo screening su larga scala e l’ottimizzazione dei modulatori per convalidare la modulazione del microbioma e prevedere i benefici relativi alla salute può essere praticamente difficile a causa della necessità di un gran numero di animali e/o soggetti umani. A tal fine, i modelli in vitro o ex vivo possono facilitare lo screening preliminare dei modulatori del microbioma. Qui, è ottimizzato e dimostrato un sistema di coltura microbiota fecale ex vivo che può essere utilizzato per esaminare gli effetti di vari interventi di modulatori di microbioma intestinale tra cui probiotici, prebiotici e altri ingredienti alimentari, oltre a nutraceutici e droghe, sulla diversità e la composizione del microbiota intestinale umano. L’inulina, uno dei composti prebiotici e modulatori del microbioma più studiati, viene utilizzato come esempio qui per esaminarne l’effetto sulla composizione sana del microbiota fecale e sulle sue attività metaboliche, come il pH fecale e i livelli fecali di acidi organici compresi gli acidi grassi lattati e a catena corta (SCFA). Il protocollo può essere utile per studi volti a stimare gli effetti di diversi interventi di modulatori sui profili microbiota fecale e a prevedere il loro impatto sulla salute.

Introduction

Il microbiota umano è una comunità complessa composta da batteri, archei, virus e microbi eucarioti1, che abitano il corpo umano internamente ed esternamente. Prove recenti hanno stabilito il ruolo fondamentale del microbiota intestinale e del microbioma intestinale (l’intera raccolta di microbi e dei loro geni presenti nel tratto gastrointestinale umano) in varie malattie umane, tra cui l’obesità, il diabete, malattie cardiovascolari e il cancro1,2,3. Inoltre, i microrganismi che vivono nel nostro intestino producono un ampio spettro di metaboliti che influenzano significativamente la nostra salute e possono anche contribuire alla fisiopatologia di diverse malattie, nonché una varietà di funzioni metaboliche4, 5.I cambiamenti anomali (perturbazioni) nella composizione e nella funzione di questa popolazione microbica intestinale sono generalmente definita come “disbiosi intestinale”. La disbiosi è di solito associata a uno stato malsano dell’ospite e quindi può essere differenziata dalla normale comunità microbica (omeostatica) associata a uno stato di controllo sano dell’ospite. Modelli specifici di disbiosi del microbioma intestinale si trovano spesso in varie malattie diverse1,2,3,6,7.

La fermentazione di alimenti non digeriti, in particolare i carboidrati/fibre fermentabili, da parte del microbiota intestinale non solo produce energia, ma produce anche metaboliti divergenti tra cui acidi grassi a catena corta (SFA), lattati, formate, anidride carbonica, metano, idrogeno ed etanolo6. Inoltre, il microbiota intestinale produce anche una serie di altre sostanze bioattive come folato, biotina, trimetilamina-N-ossido, serotonina, tritofano, acido gamma-aminobutirico, dopamina, noradrenalina, acetilcolina, istamina, deossicolico acido, e 4-ethylphenyl solfato. Ciò avviene principalmente attraverso l’utilizzo di flussi metabolici intrinseci all’interno della nicchia host-microbe, che contribuisce in diversi processi del corpo, funzioni metaboliche e cambiamenti epigenetici1,8,9, 10. Tuttavia, gli effetti di vari interventi su tali prodotti microbici rimangono sconosciuti o poco chiari a causa della mancanza di protocolli facili, efficienti e riproducibili. La composizione del microbiota intestinale umano è un ecosistema estremamente complesso e diversificato, e quindi, molte domande sul suo ruolo nella salute umana e nella patologia della malattia rimangono ancora senza risposta. Gli effetti di molti modulatori comuni del microbioma intestinale (ad esempio, probiotici, prebiotici, antibiotici, trapianti fecali e infezioni) sulla composizione e sulle funzioni metaboliche del microbiota intestinale rimangono in gran parte sfuggenti. Inoltre, l’esame e la convalida di questi effetti in vivo è difficile, in particolare perché la maggior parte dei nutrienti e dei metaboliti prodotti dal microbiota intestinale vengono assorbiti o smaltiti simultaneamente e rapidamente nell’intestino; pertanto, misurare la produzione, la quantità e la lavorazione di questi metaboliti (ad esempio, SCFA) in vivo rimane ancora una sfida pratica. Infatti, modelli fisiologici come animali e soggetti umani sono fondamentali per determinare il ruolo del microbioma intestinale e la sua modulazione sulla salute dell’ospite, ma questi potrebbero non essere adatti per lo screening su larga scala di diversi tipi di modulatori del microbioma a causa vincoli etici, monetari o temporali. A tal fine, i modelli in vitro e/o ex vivo, come la coltura del microbiota intestinale in vitro e poi intervenendo con diversi modulatori del microbiota, possono offrire opportunità di risparmio di tempo e denaro e quindi possono consentire uno screening preliminare o su larga scala vari componenti (come probiotici, prebiotici e altri composti interventistici) per esaminare/prevedere i loro effetti sulla diversità del microbiota fecale, composizione e profili metabolici. Studi che utilizzano tali sistemi in vitro ed ex vivo del microbioma intestinale possono facilitare un’ulteriore comprensione delle interazioni ospite-microbioma che contribuiscono alla salute e alla malattia dell’ospite e potrebbero anche portare a trovare nuove terapie che colpisce il microbioma migliorare la salute dell’ospite e prevenire e trattare varie malattie1.

Anche se i sistemi di coltura del microbiota intestinale in vitro non sono in grado di replicare realmente le condizioni intestinali effettive, diversi laboratori si sono sforzati di sviluppare tali modelli, alcuni dei quali sono stati ritenuti attuabili in una certa misura e sono stati utilizzati con successo per scopi diversi. Uno dei modelli intestinali recenti è il Simulatore dell’ecosistema microbico intestinale umano, che imita l’intero tratto gastrointestinale umano, tra cui lo stomaco, l’intestino tenue e diverse regioni del colon. Tuttavia, tali modelli tecnicamente complessi potrebbero non essere accessibili ad altre strutture di ricerca in tutto il mondo. Pertanto, c’è ancora una necessità critica per lo sviluppo di nuovi modelli alternativi che sono relativamente semplici, convenienti e pratici per i laboratori che studiano i modulatori del microbioma e i loro effetti sul microbiota intestinale e sulla salute dell’ospite. Quindi, l’uso di un sistema di coltura del microbiota fecale in vitro (o ex vivo) sarebbe utile per studiare gli effetti di tali interventi11,12. In particolare, l’effetto di diversi prebiotici sulla capacità di fermentazione del microbiota in termini di cambiamenti periodici nella diversità e nella composizione del microbiota intestinale, nel pH fecale e nei livelli di metaboliti microbici, tra cui SCFA e lattato, può essere studiato 13. L’uso dell’inulina (uno dei componenti prebiotici più studiati) come esempio del modulatore del microbioma, viene descritto un protocollo passo-passo di questo semplice sistema di coltura in batch ex vivo microbiota per dimostrare il suo uso per stimare cambiamenti nel microbiota fecale e metaboliti microbici a seguito dell’intervento con i modulatori del microbioma.

Protocol

INFORMATIVA: consultare le schede tecniche di sicurezza dei materiali appropriate e seguire le istruzioni e le linee guida per l’adeguata formazione sul livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Seguire tutti i passaggi di coltura secondo le regole standard di biosicurezza e utilizzare un cabinet BSL-2 utilizzando condizioni asettiche. Inoltre, campioni fecali provenienti da diversi modelli e soggetti umani possono avere il rischio potenziale di diffondere malattie microbiche. Immediatamente cercare aiuto medico nel verificarsi…

Representative Results

Il protocollo è utilizzato per dimostrare l’effetto di un prebiotico specifico (cioè l’inulina sulla composizione del microbiota e sulle attività metaboliche in termini di cambiamenti nel pH fecale e la concentrazione di lattato e SCFA nelle feci di soggetti umani sani diversi punti temporali dopo il trattamento con inulina). Il pH fecale, i livelli fecali di lattato e SCFA (Figura1) e la composizione del microbiota (Figura 2 …

Discussion

Il modello di fermentazione dei liquami fecali in vitro qui presentato è un semplice modello monolotto per approssimare gli effetti di diversi substrati e ceppi microbici (ad esempio, prebiotici e probiotici) sulla composizione del microbiota fecale umano e la sua attività metaboliche in termini di pH fecale e livelli di SCFAs. I risultati qui presentati dimostrano che l’inoculazione dell’inulina diminuisce il pH fecale e aumenta significativamente i livelli di SCFA e lattato in esemplari fecali trattati inulina rispet…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono con gratitudine il supporto di finanziamento del Center for Diabetes, Obesity and Metabolism e del Clinical and Translational Science Center, della Wake Forest School of Medicine, del Department of Defense funding (Numero di sovvenzione: W81XWH-18-1-0118), la kermit Glenn Phillips II Presidente in Medicina Cardiovascolare; il National Institutes of Health ha finanziato il Claude D. Pepper Older Americans Center (finanziato da P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e il Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, finanziato da UL1TR001420), sono stati riconosciuti per fortuna. Ringraziamo anche i volontari per aver fornito campioni fecali e gli altri membri del laboratorio per i loro aiuti tecnici durante questo esperimento.

Materials

Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGI C2388 Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) Sigma-Aldrich 255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) Acros organics 2063450000 Toxic, Irritating
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C121800
D-biotin Sigma-Aldrich B4501
D-Pantothenic acid Alfa Aesar A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) Biorad 1610729
DL-α-methylbutyrate Sigma-Aldrich W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) Sigma-Aldrich F8263 Toxic
Folic acid Alfa Aesar J62937
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hemin Sigma-Aldrich H9039
Hepes Alfa Aesar A14777
Isobutyrate Alfa Aesar L04038
Isovalerate Alfa Aesar A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) Sigma-Aldrich M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) Sigma-Aldrich 221279
Niacin (Nicotinic acid) Sigma-Aldrich N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) Alfa Aesar A14366 Toxic
N-valerate Sigma-Aldrich 240370
P-aminobenzoic acid MP China 102569 Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4) Sigma-Aldrich P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) Sigma-Aldrich 1551128
Pyridoxine Alfa Aesar A12041
Resazurin Sigma-Aldrich R7017
Riboflavin Alfa Aesar A11764
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich 1613757
Sodium chloride (NaCl) Fisher BioReagents 7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Chemicals S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) Acros organics 206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) Acros organics 148991000
Trypticase BD Biosciences 211921
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) Sigma-Aldrich Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter InVitrogen
Vortex Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system Waters Corporation

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Ahmadi, S., Wang, S., Nagpal, R., Mainali, R., Soleimanian-Zad, S., Kitzman, D., Yadav, H. An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota. J. Vis. Exp. (149), e59524, doi:10.3791/59524 (2019).

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