Культивирование и измерение фетального и новорожденного Мурина длинные кости

Рост органа должен быть плотно настроен, чтобы предотвратить возникновение расстройств роста, и включает регулирование нескольких типов клеток, молекулярных путей и перекрестных помех между различными частями тела. Методы визуализации имеют важное значение для решения изменений, происходящих с течением времени в растущий эмбрион, как в нормальных условиях, а также после того, как возмущение индуцируется в системе. Эмбрионы с внутриутробного развития, таких, как широко используемых моделей грызунов, представляют собой дополнительную проблему для живой визуализации и медикаментозного лечения, которые могут быть частично преодолены с помощью ex естественных методов культуры. Для успешного резюмировать в естественных условиях процессов и получить значимые результаты, становится решающим, чтобы найти правильные условия культивирования для каждого органа или ткани.

Большинство костей скелета млекопитающих расти через эндохондрал окостенение, где эмбрионального хряща (состоит из клеток, называемых хондроцитов) диски продольного роста и постепенно заменяется костью. Этот процесс происходит на пластин роста, расположенных в конце длинных костей, где можно выделить три зоны: отдых, пролиферативный, и гипертрофическая^1,2. Во-первых, круглые хондроциты-предшественники в зоне отдыха переходят в велосипедную колумнарную хондроциты в пролиферативной зоне. Во время следующего этапа дифференциации, эти хондроциты становятся гипертрофических и начать секреции типа X коллагена. Гипертрофические хондроциты организуют последующие шаги окостенения: они выделяют ключевые сигнальные молекулы, такие как фактор роста соединительной ткани, костные морфгенетические белки и Индийский еж, и направляют минерализацию матрицы, вербуют кровеносные сосуды к центральной части кости, и, после апоптоза, позволяют остеобластов (костно-образующие клетки) вторгнуться в матрицу, чтобы сформировать первичный центр окостенения^3,4. Минерализованная матрица облегчает проникновение кровеносных сосудов, через которые остеобласты мигрируют, чтобы заменить этот деградирующий хрящ матрицей⁵. Большинство остеобластов вторгнуться хряща матрицы из перичондриум, волокнистый слой, который обертывания хряща⁶. Кроме того, доля гипертрофических хондроцитов способны выживать и трансдифференцироваться в остеобласты^7,8,9. Окончательная длина кости обусловлена накопленным ростом переходного хряща, темп роста которого в свою очередь зависит от количества и размера гипертрофических хондроцитов, а их матричной продукции¹⁰. Кроме того, недавно было показано, что продолжительность последней фазы гипертрофии коррелирует с окончательной длины кости¹¹. Поэтому для обеспечения правильного размера кости требуется жесткая регуляция распространения и дифференциации этих клеток.

Несмотря на существенные знания, полученные за годы работы по организации и развитию плит роста, большинство этих выводов основано на наблюдении за фиксированными гистологическими секциями. Секционирование тканей предоставляет ценную информацию об этом процессе, но может использоваться с техническими артефактами, поэтому он не может быть всегда надежно использован для оценки морфологических или изменения размера между различными этапами. Кроме того, как рост костей является динамичным процессом, статические двумерные (2D) изображения предлагают ограниченное понимание движения клеток в пластины роста, в то время как покадровой визуализации на живой ткани может предложить ценную информацию о поведении хондроциты в пластины роста.

Все эти ограничения могут быть потенциально решены с использованием бывших естественных культур костей. В то время как костная культура протоколы были разработаны некоторое время назад, они были безгранично применительно к мышиных длинных костей. Большинство исследований использования куриных костей из-за технических преимуществ, предлагаемых цыпленок модель^12,13. Органотипных культур (воздух/жидкость интерфейс) были применены к куриных эмбриональных бедренные кости, которые были сохранены в культуре в течение 10 дней¹⁴. Сложные генетические инструменты, доступные в мыши делают эту модель очень привлекательной для использования в бывших естественных костной культуры. Исследования, которые использовали мышей, чтобы заглянуть в рост костей работал в основном с плюсневой кости¹⁵, вероятно, из-за их небольшого размера и больших чисел, полученных на эмбрион¹⁶. Хотя традиционно считается длинные кости, плюмси введите старение (характеризуется сокращение распространения и инволюции роста пластины¹⁷) раньше, чем другие длинные кости в естественных условиях, и, следовательно, их непрерывный рост ex естественных условиях не действительно резюмировать в процессе естественных условиях. Для целей этой статьи, мы будем использовать термин длинные кости для костей из проксимальных и промежуточных областей конечностей. Несколько предыдущих исследований использовали длинные Мурины кости, такие как голени, в ex естественных условиях культуры и наблюдается существенный рост хряща, но мало окостенение¹⁸. В последнее время мы также использовали тиберетик культуры, в основном для изучения хондроцитов динамики¹⁹. Другие исследования использовали бедренные головки от молодых мышей²⁰ или только дистальной части бедренной кости для культуры²¹. Некоторые более поздние работы успешно сочетать ex в естественных условиях культуры полных костей с покадровой визуализации для приобретения трехмерных (3D) фильмы хондроцитов в живых мышь ткани^22,23. Авторы сумели наблюдать ранее незамеченные события в перестановке хондроцитов к пролиферативной зоне²³ в хорошем примере потенциального применения костной культуры ex естественных условиях. Альтернатива, т.е. анализ статических изображений, требует косвенных и сложных приемов. Примером тому служит недавнее исследование, оценивающий важность трансверсально-ориентированных клонов для роста хрящей, где генетическая трассировка с многоразнос-репортерным штаммами мыши в сочетании с математическим моделированием использовалась²⁴. Таким образом, ex естественных условиях культуры может помочь получить представление о динамических процессов в быстрее и более простой способ.

Здесь, мы представляем метод для мышиных длинных костей культуры, которые могут быть объединены с различными молекулярными процедурами и/или с покадровой живой визуализации. Этот протокол адаптирует методы, используемые в предыдущих докладах^15,18,²⁵, но рассматриваются некоторые дополнительные вопросы и фокусируется на длинных костей, таких как большеберцовой кости, а не плюсневых костей. Наконец, он исследует потенциал использования статистически мощных спаренных сравнений по выращиванию левой и правой костей отдельно в присутствии различных веществ.