Özet

Coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale

Published: April 26, 2019
doi:

Özet

Qui, presentiamo un metodo per la coltura ex vivo di ossa lunghe murine sia a stadi fetali che neonati, adatto per l’analisi dello sviluppo osseo e della cartilagine e dell’omeostasi in condizioni controllate, ricapitolando il processo in vivo.

Abstract

Le ossa lunghe sono strutture complesse e dinamiche, che derivano dall’ossificazione endocondrale attraverso una cartilagine intermedia. L’accesso limitato a ossa umane sane rende particolarmente prezioso l’uso di modelli di mammiferi, come topo e ratto, per esaminare diversi aspetti della crescita ossea e dell’omeostasi. Inoltre, lo sviluppo di sofisticati strumenti genetici nei topi consente studi più complessi di crescita ossea lunga e richiede un’espansione delle tecniche utilizzate per studiare la crescita ossea. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura ossea ex vivo murina, che consente lo studio dell’osso e della cartilagine in modo strettamente controllato, ricapitolando la maggior parte del processo in vivo. Il metodo descritto permette la coltura di una gamma di ossa, tra cui tibia, femore, e ossa metatarsali, ma ci siamo concentrati principalmente sulla cultura tibiale qui. Inoltre, può essere utilizzato in combinazione con altre tecniche, come l’imaging Live time-lapse o il trattamento farmacologico.

Introduction

La crescita degli organi deve essere strettamente sintonizzata per prevenire la comparsa di disturbi della crescita, e coinvolge la regolazione di diversi tipi di cellule, vie molecolari e crosstalk tra diverse parti del corpo. Le tecniche di imaging sono essenziali per affrontare i cambiamenti che si verificano nel corso del tempo in un embrione in crescita, sia in condizioni normali, così come dopo una perturbazione è indotta nel sistema. Gli embrioni con sviluppo intrauterino, come i modelli di roditori ampiamente utilizzati, presentano una sfida aggiuntiva per l’imaging dal vivo e il trattamento farmacologico, che può essere parzialmente superato utilizzando tecniche di coltura ex vivo. Per ricapitolare con successo i processi in vivo e ottenere risultati significativi, diventa cruciale trovare le giuste condizioni di coltura per ogni organo o tessuto.

La maggior parte delle ossa dello scheletro dei mammiferi crescono attraverso l’ossificazione endocondrale, dove la cartilagine embrionale (composta da cellule chiamate condrociti) spinge la crescita longitudinale e viene gradualmente sostituita dall’osso. Questo processo avviene alle piastre di crescita, situate alla fine delle ossa lunghe, dove si distinguono tre zone: riposo, proliferativo e ipertrofico1,2. In primo luogo, i condrociti progenitrici rotondi nella zona di riposo transitano nei condrociti colonnari ciclistici nella zona proliferativa. Durante la successiva fase di differenziazione, questi condrociti diventano ipertrofici e iniziano a secchire il collagene di tipo X. I condrociti ipertrofici orchestrano le fasi successive di ossificazione: secernono molecole di segnalazione chiave, come il fattore di crescita del tessuto connettivo, le proteine morfogenetiche ossee e il riccio indiano, e dirigono la mineralizzazione della matrice, reclutano vasi sanguigni alla parte centrale dell’osso, e, su apoptosi, consentire osteoblasti (cellule che formano ossa) per invadere la matrice per formare il centro di ossificazione primaria3,4. La matrice mineralizzata facilita la penetrazione dei vasi sanguigni attraverso i quali gli osteoblasti migrano per sostituire questa cartilagine degradata con una matrice ossea5. La maggior parte degli osteoblasti invade la matrice cartilaginea dal perichdri, uno strato fibusto che avvolge la cartilagine6. In alternativa, una proporzione di condrociti ipertrofici è in grado di sopravvivere e di trasdifferenziarsi agli osteoblasti7,8,9. La lunghezza finale dell’osso è dovuta alla crescita accumulata della cartilagine transitoria, il cui tasso di crescita a sua volta dipende dal numero e dalle dimensioni dei condrociti ipertrofici e dalla loro produzione di matrici10. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la durata dell’ultima fase dell’ipertrofia è correlata alla lunghezza finale dell’osso11. Pertanto, è necessaria una stretta regolazione della proliferazione e differenziazione di queste cellule per garantire la corretta dimensione ossea.

Nonostante le conoscenze sostanziali acquisite nel corso degli anni sull’organizzazione e lo sviluppo delle piastre di crescita, la maggior parte di queste conclusioni si basano sull’osservazione delle sezioni istologiche fisse. Il sezionamento dei tessuti fornisce informazioni preziose su questo processo, ma può essere guidato con artefatti tecnici, quindi non può essere sempre utilizzato in modo affidabile per stimare i cambiamenti morfologici o dimensionali tra le diverse fasi. Inoltre, poiché la crescita ossea è un processo dinamico, le immagini statiche bidimensionali (2D) offrono una visione limitata del movimento delle cellule nella piastra di crescita, mentre l’imaging time-lapse sul tessuto vivo potrebbe offrire informazioni preziose sul comportamento del condrociti nella piastra di crescita.

Tutte queste limitazioni possono essere potenzialmente risolte utilizzando colture ossee ex vivo. Mentre i protocolli di coltura ossea sono stati sviluppati qualche tempo fa, sono stati limitatamente applicati alle ossa lunghe murine. La maggior parte degli studi usa le ossa delle pollastrelle a causa dei vantaggi tecnici offerti dal pulcino modello12,13. Le colture organotipiche (interfaccia aria/liquido) sono state applicate ai femori embrionali di pulcino, che sono stati mantenuti in coltura per 10 giorni14. I sofisticati strumenti genetici disponibili nel topo rendono questo modello molto attraente per essere utilizzato nella coltura ossea ex vivo. Gli studi che hanno usato i topi per esaminare la crescita ossea hanno funzionato principalmente con le ossa metatarsali15, probabilmente a causa delle loro piccole dimensioni e dei numeri maggiori ottenuti per embrione16. Sebbene tradizionalmente considerate ossa lunghe, metatarsi entrano in senescenza (caratterizzata da ridotta proliferazione e involuzione della piastra di crescita17) prima di altre ossa lunghe in vivo, e quindi la loro continua crescita ex vivo non davvero ricapitolare il processo in vivo. Ai fini di questo articolo, useremo il termine ossa lunghe per le ossa delle regioni degli arti prossimali e intermedie. Diversi studi precedenti hanno usato ossa lunghe murine, come la tibia, in colture ex vivo e osservato una crescita sostanziale della cartilagine, ma poca ossificazione18. Abbiamo anche usato le colture tibiali recentemente, principalmente per studiare la dinamica dei condrociti19. Altri studi hanno usato teste femorali da giovani topi20 o solo la parte distale del femore per la cultura21. Alcune opere più recenti combinano con successo la cultura ex vivo di ossa piene con imaging time-lapse per acquisire film tridimensionali (3D) di condrociti nel tessuto vivente del topo22,23. Gli autori sono riusciti ad osservare eventi precedentemente inosservati nel riarrangiamento dei condrociti alla zona proliferativa23 in un buon esempio della potenziale applicazione della coltura ossea ex vivo. L’alternativa, cioè l’analisi delle immagini statiche, richiede tecniche indirette e complesse. Questo è stato esemplificato da un recente studio che ha valutato l’importanza di cloni orientati alla trasversalmente per la crescita della cartilagine, dove il tracciamento genetico con ceppi di topo reporter multicolore accoppiato con la modellazione matematica sono stati utilizzati24. Pertanto, la cultura ex vivo potrebbe contribuire a ottenere informazioni sui processi dinamici in modo più rapido e diretto.

Qui, presentiamo un metodo per la cultura ossea lunga murina, che può essere combinata con diversi trattamenti molecolari e/o con Time-lapse Live Imaging. Questo protocollo adatta i metodi utilizzati nelle precedenti relazioni15,18,25, ma affronta alcuni problemi aggiuntivi e si concentra su ossa lunghe come la tibia, piuttosto che le ossa metatarsali. Infine, Esplora il potenziale dell’utilizzo di confronti associati statisticamente potenti Culturando le ossa sinistra e destra separatamente in presenza di diverse sostanze.

Protocol

Tutti gli esperimenti devono essere svolti seguendo le linee guida governative e istituzionali locali di manipolazione etica degli animali da laboratorio. 1. preparativi prima del giorno della coltura ossea Impostare le accoppiamenti temporizzate del mouse per ottenere feti e cuccioli dal giorno embrionale 14,5 (e 14.5) e successivi.Nota: La cultura delle ossa lunghe può essere applicata con successo a diversi ceppi di topo; nel presente protocollo vengono utili…

Representative Results

La coltura ossea può essere eseguita partendo da diverse fasi. Nella Figura 1a-D, viene mostrato un confronto tra la tibia coltivata e quelle appena estratte in fasi equivalenti. La prima osservazione è che fino a due giorni di cultura le dimensioni raggiunte sono paragonabili alla crescita ossea in vivo sia per la cartilagine che per l’osso mineralizzato (Figura 1a, B, D). Periodi di coltura p…

Discussion

I metodi di coltura ossea ex vivo sono stati usati per un certo tempo per valutare la biologia della crescita ossea28, ma sono stati raramente applicati alle ossa lunghe murine. Con lo sviluppo di tecniche di imaging, la coltura ossea ex vivo offre un modo attraente per studiare la crescita ossea in tempo reale in un ambiente che assomiglia strettamente alle condizioni in vivo. In questo scenario, è importante definire le condizioni in cui la crescita delle ossa lunghe è paragonabile alla loro c…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Alexandra Joyner per il suo sostegno quando questo protocollo è stato istituito, Edwina McGlinn e Yi-Cheng Chang per la condivisione di acido retinoico. L’Istituto australiano di medicina rigenerativa è supportato da sovvenzioni del governo statale di Victoria e del governo australiano.

Materials

5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Santa Cruz CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridine Sigma B5002
50mL Conical Centrifuge Tubes Falcon 352070
60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile Falcon 353037
Adobe Photoshop Adobe CS4
Ascorbic acid Sigma A92902
Base unit for the scope Zeiss 435425-9100-000
Betaglycerophosphate Sigma G9422
Binocular scope Zeiss STEMI-2000
Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v Roche/Sigma 10735086001
DigiRetina 500 camera Aunet
Dissection kit Cumper Robbins PFS00034
DMEM Gibco 11960044
DMSO Sigma D8418
Eppendorf 2-mL tubes Eppendorf 0030120094
Ethanol 96% Merk 159010
Forceps Dumont#5 Inox08 Fine Science Tools T05811
Heracell 150 CO2 incubator Thermo Fisher 51026282
Minimum Essential Medium Eagle Sigma M2279
Multiwell 24 well Falcon 353047
Paraformaldehyde Sigma 158127
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped Thermo 273
Syringe filter 0.2 um  Life Sciences PN4612
Terumo syringe 20 mL Terumo DVR-5174
Tretinoin (retinoic acid) Sigma PHR1187-3X
Trinocular scope Aunet AZS400T

Referanslar

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