An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Lauren  S. Sherman; Alexandra Cond&#233;-Green; Yahaira Naaldijk; Edward  S. Lee; Pranela Rameshwar

doi:10.3791/59419

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Tıp

Un método libre de enzimas para el aislamiento y la expansión de las células madre mesenquimales derivadas de adiposo humano

Published: December 16, 2019

doi:

10.3791/59419

Lauren S. Sherman^1,2, Alexandra Condé-Green³, Yahaira Naaldijk¹, Edward S. Lee³, Pranela Rameshwar^1,2

¹Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, New Jersey Medical School,Rutgers Biomedical and Health Sciences, ²Rutgers School of Graduate Studies at New Jersey Medical School,Rutgers Biomedical and Health Sciences, ³Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, New Jersey Medical School,Rutgers Biomedical and Health Sciences

Özet

Este protocolo proporciona un método libre de enzimas para aislar las células madre mesenquimales de muestras de abdominoplastia y lipoaspiración utilizando un método explantado. La ausencia de enzimas duras o pasos de centrifugación proporciona células madre clínicamente relevantes que pueden utilizarse para estudios in vitro o transferirse de vuelta a la clínica.

Abstract

Las células madre mesenquimales (CPS) son una población de células multipotentes que se pueden aislar de varios tejidos adultos y fetales, incluido el tejido adiposo. Como un tipo de célula clínicamente relevante, se necesitan métodos óptimos para aislar y expandir estas células in vitro. La mayoría de los métodos para aislar los MAC derivados de los adiposos (ADSC) se basan en enzimas duras, como la colagenasa, para digerir el tejido adiposo. Sin embargo, si bien son eficaces para descomponer el tejido adiposo y producir una alta recuperación de ADSC, estas enzimas son costosas y pueden tener un efecto perjudicial en los AED, incluidos los riesgos del uso de componentes xenogénicos en aplicaciones clínicas. Este protocolo detalla un método para aislar los ADSC de muestras frescas de lipoaspiración y abdominoplastia sin enzimas. Brevemente, este método se basa en la desasociación mecánica de cualquier tejido a granel seguido de un sistema de cultivo de tipo explanta. Los ADSC pueden migrar fuera del tejido y de la placa de cultivo de tejidos, después de lo cual los AdsC pueden ser cultivados y ampliados in vitro para cualquier número de investigación y/o aplicaciones clínicas.

Introduction

Las células madre mesenquimales (MSC) son una clase de células madre adultas multipotentes que se pueden aislar de varios tejidos adultos y fetales, incluso del tejido adiposo. Estas células son un tipo de célula atractivo tanto para la investigación básica como para las aplicaciones clínicas debido a su plasticidad para diferenciarse en células de todas las capas germinales in vitro, barreras alogénicas cruzadas, hogar de áreas de inflamación, y suprimir la inflamación (revisado en Sherman, et al.¹). Los MSC derivados de adiposos (ASC) son particularmente atractivos debido a su facilidad de obtención, ya que el tejido adiposo generalmente se considera tejido descarte después de procedimientos de liposucción y abdominoplastia de rutina. Sin embargo, una vez obtenidas, las muestras generalmente se someten a condiciones adversas, ya sea condición enzimática o centrifugación, con el fin de aislar los^ASC2,³. Este método ilustra un procedimiento simple para aislar los ASC utilizando un método de explantación, en ausencia de pasos enzimáticos o centrifugatos severos.

El método más común de aislar los ASC consiste en lavar una muestra adiposa, digerir enzimáticamente la muestra con colagenasa, centrifugar la muestra y, finalmente, lisiar los glóbulos rojos antes de cultivar los ASC^4. Si bien es eficiente para aislar un alto rendimiento de ASCs, el uso de componentes xenogénicos (por ejemplo, digestión enzimática con colagenasa) se considera más que “mínimamente manipulado” por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, y puede plantear riesgos como la reacción inmune, prohibiendo el uso de las células en la clínica⁵^,⁶. Para minimizar los riesgos de los componentes xenogénicos, muchos grupos han sugerido enzimas fabricadas no derivadas de animales para digerir el tejido adiposo. Sin embargo, estas enzimas siguen siendo duras, y pueden alterar el fenotipo celular⁷.

Otros métodos de aislamiento de los ASC incluyen centrifugación de alta velocidad, uso de fuerzas de hasta 1.200 x g,y vórtice para aislar los ASC^8. Incluso fuerzas tan bajas como 400 x g fueron suficientes para aislar ASCviables viables⁹. Mientras que estas células producen una gran cantidad de células viables, muchos protocolos no proliferaron más allá de 14 días^8. Además, el aislamiento mecánico produce menos células recuperadas que la digestión enzimática, pero una mayor proporción de células aisladas fueron ASC en comparación con otras células endógenas al tejido adiposo en el paso 0^10.

El aislamiento de una población más pura y viable de ASC en menos tiempo, junto con el costo y los riesgos de los componentes xenogénicos, hace que la digestión enzimática sea cada vez menos atractiva para su traducción a la clínica. Si bien el aislamiento mecánico es inicialmente un enfoque favorable, hay una disparidad significativa en los métodos utilizados, y el volumen de tejido procesado se limita al tamaño de las unidades centrífugas especializadas, y puede depender de la consistencia del operador^2.

Mientras que tanto la digestión enzimática como la centrifugación producen rápidamente un alto volumen de ASC, estas células aisladas muestran cambios fenotípicos, lo que produce preguntas sobre su comportamiento cuando se devuelve a un paciente^2. Por lo tanto, algunos grupos están empleando un método explant de aislamiento ASC, tal como se describe en este protocolo, mediante el que los ASC migran de pequeños trozos de tejido adiposo sólido³^,¹¹^,¹². Esta migración es probablemente un efecto de las células que se sienten atraídas a los medios ricos en nutrientes. Al igual que otras poblaciones de MSC, los ASC se adhieren al plástico, y sobreviven y proliferan en los medios de cultivo de tejido utilizado (componentes a continuación), lo que permite su aislamiento de los otros tipos de células del tejido adiposo. Si bien se recuperan inicialmente menos células ,a menudo tomando > 1 semana hasta que las células sean visibles en la placa de cultivo de tejido— estos ASC sin manipular proliferarán in vitro, permitiendo la expansión de las células a volúmenes clínicamente relevantes¹¹^,¹²^,¹³.

Protocol

El uso de muestras de lipoaspirate y abdominoplastia ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad Rutgers — Newark Campus. 1. Preparación de medios de cultivo de tejidos Preparar estérilmente 500 ml de medios de cultivo de tejido antes de aislar los ASC. Para preparar los medios de cultivo, añada un 10% de suero de becerro fetal definido (FCS) y penicilina-estreptomicina (10.000 U/100 ml) al medio esencial mínimo (DMEM) de Dulbecco con alta glucosa y 2 mM de L-glutamina. El soporte se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 semanas y siempre debe utilizarse en caliente (entre temperatura ambiente y 37 oC). Si se prefiere un medio diferente para el cultivo de las células madre, prepare ese medio en su lugar. 2. Aislamiento de ASCs del tejido adiposo Obtener lipoaspirateis o muestra(s) de abdominoplastia. Después de la aprobación de la IRB, obtenga muestras tales como tejido de saque después de varios procedimientos quirúrgicos. Transportar los lipoaspirateos al laboratorio en cualquier recipiente que el cirujano extraiga el tejido; transportar muestras de abdominoplastia en una bolsa o contenedor de muestras de quirófano. Conservar la(s) muestra(s) a temperatura ambiente durante un máximo de 6 h o a 4oC durante un máximo de 24 h si no se procesa inmediatamente. Las muestras de tejido procesadas más allá de los tiempos antes mencionados probablemente tendrán un rendimiento celular disminuido. Mantenga húmedas las muestras de abdominoplastia mediante la adición de 1 solución salina tamponada de fosfato estéril. A partir de este punto, realice todos los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones asépticas. Use guantes para la protección personal. Mantenga un 10% de lejía, 70% de etanol y toallas de papel cerca para limpiar rápidamente cualquier derrame biológico. Desechada de cualquier exceso de tejido como residuo biomédico. Mince las muestras en < 1 mm piezas. Si el bloque de abdominoplastia es demasiado grande para trabajar, corte un tamaño manejable de tejido del bloque antes de picar. Transfiera el tejido de abdominoplastia a la tapa de una placa estéril de 100 mm. Use una aguja estéril para mantener un pedazo de tejido en su lugar y use un bisturí estéril para eliminar las piezas cortando o triturando suavemente el tejido a granel. Este paso generalmente no es necesario para lipoaspirateos. Sin embargo, si se observan trozos de tejido grandes en el lipoaspirato, eliminar tales trozos con fórceps estériles y procesar como arriba. Transfiera el tejido a un tubo nuevo e invierta o agite la muestra de 5 a 6 veces para asegurar la mezcla de todas las capas. Opcional: si el lipoaspirateo se ha asentado por completo, retire y deseche la capa de aceite antes de mezclar. Transfiera de 2,5 a 5 ml de tejido a una placa de cultivo de tejido tratada con plasma de gas de vacío de 100 mm(Tabla de materiales). Mida el volumen de la muestra vertiendo en un tubo de centrífuga fresco. Si es necesario, utilice una espátula estéril para ayudar a transferir el tejido. Agregue un volumen equivalente de medios de cultivo de tejidoa a la placa. Gire suavemente la placa para mezclar el contenido. Incubar las palmadas a 37 oC en 5% co2 hasta que se averien un número suficiente de células en la base de la placa. Con el tiempo, las células migrarán desde dentro del tejido a la superficie de la placa, momento en el que se adhieren al plástico. A medida que salen del tejido, las células aparecerán como pequeños racimos alrededor de las piezas de tejido. Cada 24 h, retire tanto líquido como sea posible y sustitúyalo por una cantidad similar de medios. Deje los trozos de tejido en su lugar, si es posible. Una vez que un número suficiente de células se observan en la placa (>10 racimos de > 15–25 células en la placa) o después de 7 días, lo que sea antes, retire todos los pedazos restantes de tejido. Cultivo de los ASC en medios de cultivo de tejido hasta que alcancen el 70% de confluencia o hasta que los racimos se vuelvan densos (>5 racimos densos de células en la placa, cada uno con un diámetro de aproximadamente > 500 m), momento en el que las células deben ser pasajes. 3 Cultura de asCs Pasaje de los ASC cuando la placa padre alcance aproximadamente el 70% de confluencia. Tenga cuidado de evitar la confluencia excesiva de las culturas ASC. Enjuague suavemente la placa con 1 solución salina tamponada con fosfato y intente triplique las células adherentes. Para trippsinizar las células, aspirar la solución salina tamponada fosfato y añadir 1 ml de trippsina con 0.25% EDTA a cada placa e incubar a 37 oC durante 5 min. Después de 5 min, confirme la desadherencia mediante microscopía. Si las células siguen siendo adherentes, devuelva las células a la incubadora durante 5 minutos adicionales. Agregue una pequeña cantidad de medios (aproximadamente el 25% del volumen total de tripsina) a la placa para desactivar la trippsina, y lave suavemente la base de la placa usando el medio/trippsina. Para lavar la placa, sostenga la placa en un ángulo leve y pipetee suavemente el medio/trippsina desde la parte superior de la placa hacia abajo, aflojando las células conectadas semanalmente de la placa. Las células se pueden volver a placar en una proporción de 1:3 o sembrar a una densidad de 120,000–500,000 celdas por placa. Si la sembración se basa en el recuento celular, transfiera la tripsina/medios de la placa a un tubo centrífugo cónico, y peletizar las células por centrifugación a 300 x g durante 7 min. Para contar las células, transfiera 10 s de la suspensión celular al hemocitómetro y cuente las celdas presentes en el cuadrante 4 x 4 en cada esquina de la cuadrícula. Promedio de estos valores juntos y multiplique el valor por 104 para calcular el número de celda. Agregue medios a la placa antes de sembrar las células. Agregue las células de una manera con gota y luego gire la placa para asegurar una distribución uniforme a través de la placa.NOTA: Después de 3 pasajes, las celdas adherentes deben aparecer asimétricas y en forma de husillo. El fenotipo y el comportamiento de ASC se pueden confirmar mediante ensayos de citometría de flujo y diferenciación. Confirmación del fenotipo y comportamiento de ASC mediante ensayos de citometría de flujo y diferenciación Citometría de flujo Recoger y peletizar las células como se describió anteriormente. Lavar el peletizado con 1x solución salina tamponada de fosfato y etiquetar las células con los volúmenes de anticuerpos recomendados por el fabricante. Un protocolo detallado para la citometría de flujo, un procedimiento de laboratorio común, se puede encontrar aquí12,14,15. Seleccione los paneles de marcadores de superficie de los siguientes para confirmar el fenotipo ASC: negativo para CD14, CD31, CD34, CD45 y CD106; positivo para CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 y CD10516,17,18,19. La presencia de CD36 y la ausencia de CD106 discernen los ASC de los CPE derivados de la médula ósea20. Ensayos de diferenciación: Confirme la diferenciación multilínea utilizando un kit de diferenciación MSC. Los kits están disponibles de múltiples fabricantes para confirmar la capacidad de diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica. Cambie los medios proporcionados por el kit cada 3-4 días según los protocolos del fabricante durante 3 semanas o hasta que se observe la diferenciación morfológica. Cultivo de las celdas para múltiples pasajes; el número de pasajes necesarios dependerá de la(s) solicitud(es). En cada paso, confirme la morfología celular y el fenotipo de MSC utilizando los marcadores de superficie celular antes mencionados, y asegúrese de que no se ha perdido la capacidad de diferenciación multilínea. Si bien el potencial de expansión difiere entre los donantes, la mayoría de las muestras se pueden ampliar para hasta 6-9 pasajes. Cryoconserva las células y guárdelas en nitrógeno líquido para su uso futuro. 4 Criopreservación de ASCs Preparar 10 ml de soluciones de congelación A y B. Para congelar la solución A, agregue 20% FCS a DMEM con alta glucosa. Para congelar la solución B, agregue 20% FCS y 20% sulfuro de dimetil (DMSO) a DMEM con alta glucosa. Peletizar las células mediante centrifugación a 300 x g durante 5 min. Resuspender las células en un pequeño volumen de solución de congelación A y contar las células usando un hemocitómetro como en el paso 3.3.1. Calcule el volumen final en el que se resuspenderán las celdas para alcanzar una concentración celular final de 500.000 a 1.000.000 de células/ml. Utilice la solución de congelación A para resuspender el pellet en el 50% de ese volumen final. Añadir lentamente un volumen igual de solución de congelación B en sentido de gota mientras agita el tubo para alcanzar la concentración celular final. Congele inmediatamente las células en crioviales de 1-2 ml. Congele los crioviales en un congelador de velocidad controlada o en un recipiente de congelación colocado a -80 oC, lo que reduce la temperatura en 1 oC/min. Después de la congelación controlada (durante la noche para un recipiente de congelación), transfiera las células a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Representative Results

Utilizando el método detallado aquí, los ASC se aislaron con éxito de muestras de lipoaspiratey y abdominoplastia(Figura 1). Después de tres pasajes, se encontró que las células aisladas tenían una morfología MSC (asimétrica, forma de husillo) y fenotipo, similar a los ASC después de la digestión enzimática(Figura 2). Estudios previos de nuestro grupo y otros han demostrado que estos ASCs se diferencian en adipocitos, osteocitos y neuronas como otros MSC, incluyendo ASCs aislados por otros medios11,21. En la mayoría de los casos, la migración de ASC a la placa de cultivo de tejidos se puede visualizar en un plazo de 3 a 5 días mediante microscopía de campo brillante. Sin embargo, en algunos casos, solo las células dispersas serán visibles después de 7 días. En raras ocasiones, las células no migrarán a la placa y/o no proliferarán hasta el tercer pasaje. Este resultado generalmente se correlaciona con un retraso en el procesamiento de la muestra de tejido. Figura 1: Representación esquemática del aislamiento ASC de muestras de abdominoplastia y lipoaspirate. Se obtuvieron muestras de abdominoplastia y lipoaspirapirata según tejido de sensato siguiendo procedimientos quirúrgicos de rutina. Las muestras de abdominoplastia fueron trituradas, después de lo cual las muestras de abdominoplastia o lipoaspiración fueron chapadas como explantas en medios de cultivo de tejidos. Los ASC saligraban fuera del tejido hacia los medios ricos en nutrientes. Después de 1 semana, los explantes fueron retirados y los ASC cultivados para la experimentación posterior y / o aplicación clínica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: ASCs aislados con morfología y fenotipo MSC. Los ASC aislados por el método explanitario libre de enzimas tienen una morfología y un fenotipo MSC en el pasaje 3. (A) Al igual que otros MSC, estos ASC tienen una forma de husillo asimétrica, ya sea aislada por explantao o método enzimático (por ejemplo, colagenasa). Los ASC aislados mediante el método enzimático producen una morfología más larga y estrecha en comparación con los ASC aislados explantar; los últimos se asemejan más a los MSC derivados de otros métodos de aislamiento sin enzimas, como los MSC derivados de la médula ósea (B) Al igual que otros SCP aislados, los ASC aislados explantar son negativos para CD45 y positivos para CD73, CD90 y CD105. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los ASC son una fuente atractiva de MSCs debido al fácil acceso del tejido. Tanto para aplicaciones clínicas como de investigación, los científicos deben tener en cuenta la variabilidad de los donantes al aislar y cultivar estas células. Por razones aún por esclarecer, los MSC de diferentes donantes muestran diferentes capacidades para proliferar in vitro, lo que posteriormente afectará la migración del ASC fuera de la capacidad de explantayción adiposa y proliferación. Si bien la variabilidad se puede observar en el tiempo que tardan los ASC aislados de estos explantes libres de enzimas para alcanzar la confluencia, era raro que una muestra no proliferara in vitro.

Más allá de la variabilidad de los donantes, la fuente más probable de fracaso de las células para migrar fuera del tejido y /o proliferar in vitro es el tiempo que el tejido se almacenó antes del procesamiento. Cuando se permitió que las muestras se sentaran durante >12 h antes del procesamiento o no se mantuvieran húmedas entre la cosecha y el procesamiento, se observaron tasas más bajas de migración y proliferación. Las únicas muestras que con frecuencia no proliferaban fueron muestras de abdominoplastia que no se mantenían húmedas con una solución salina: en estos casos, el tejido en el centro del bloque de tejido era a menudo lo suficientemente húmedo como para procesar, pero ocasionalmente necesitaba ser desechado. Por lo tanto, es fundamental mantener el tejido húmedo desde el momento de la cosecha hasta el procesamiento.

En los casos en que no se observen ASC en la placa en la marca de 1 semana, los explantas adiposas todavía deben eliminarse de las placas de cultivo de tejido para que no se produzca necrosis tisular. A veces hay muy pocas células para identificar fácilmente, pero esas pocas células serán capaces de expandirse dentro del sistema de cultivo. Si las células todavía no se observan a las 3 semanas, el aislamiento debe considerarse fallido.

En algunos casos, particularmente de la abdominoplastia, no es posible obtener una muestra verdaderamente aséptica debido a las limitaciones dentro de la arena quirúrgica. Si no es posible utilizar un recipiente estéril para transportar el tejido desde el quirófano a una campana de flujo laminar, la eliminación de los 1 cm exteriores del tejido es generalmente suficiente para evitar la contaminación por microorganismos. Si la muestra de abdominoplastia está unida a la piel, la piel se puede limpiar con 70% de etanol para esterilizar esa superficie antes de picar el tejido adiposo.

Durante el proceso de picado, es fundamental que el tejido se incienda en trozos pequeños y finos. Si los explantes son demasiado grandes, no habrá suficiente superficie para que los ASC migren fuera del tejido y sobre la placa. Además, es fundamental que el tejido no permanezca en la placa más tiempo del necesario para que el tejido no se vuelva necrótico.

Una limitación de este método es el uso de una enzima (en el protocolo descrito, trippsina) para separar los ASC durante el proceso de cultivo de tejido. Otras enzimas derivadas de animales, como Accutase, pueden ser reemplazadas para eliminar la necesidad de productos derivados de animales, sin embargo, esto aumentará el costo del cultivo de tejidos. Por esta razón, entre otros, numerosos grupos están investigando métodos de cultivo de tejidos no bidimensionales como biorreactores y sistemas basados en andamios para aumentar el potencial de crecimiento de MSC y minimizar la necesidad de separar las células de su sustrato^22.

Al trasladar ASCs a la clínica, una limitación importante del método de aislamiento explano es la dependencia de una buena instalación de cultivo de tejidos a nivel de práctica de fabricación (GMP), que muchos centros médicos carecen. En estos casos, sería necesario emplear cualquiera de los métodos basados en enzimas o centrifugación autocerrados disponibles comercialmente. Sin embargo, a medida que las instalaciones de GMP se vuelven más frecuentes, se espera que este efecto sea limitado. Mientras tanto, incluso estas instalaciones que carecen de instalaciones de cultivo de tejido GMP pueden considerar el uso del método explant para el estudio de ASCin vitro: cuanto menos manipulación, más similares son estas células a sus contrapartes in vivo¹¹.

Este método proporciona una forma sencilla de aislar los ASC del tejido adiposo ,tanto lipoaspirates como abdominoplastias, en ausencia de enzimas duras o pasos de centrifugación. Mientras que el rendimiento inicial de los ASC es menor que el de otros métodos, los ASC proliferarán in vitro, minimizando el efecto del menor rendimiento inicial. La falta de manipulación excesiva o contundente hace que los ASC aislados de tal manera sean particularmente relevantes, ya que hay menos preguntas (es decir, si los efectos observados se deben a las propias células o a la manipulación de las células durante el proceso de aislamiento ).

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores no tienen reconocimientos

Materials

Dimethyl Sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
Falcon 3003 tissue culture plates	Corning	Corning
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	serum is batch tested to ensure it supports MSC growth
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049

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Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (154), e59419, doi:10.3791/59419 (2019).