Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.
Bu iletişim kuralının amacı fare embriyo diseksiyon ve ventrikül belirli floresan muhabir çakma fareler (MLC-2v-tdTomato fareler) kullanarak kalp geliştirme sırasında embriyonik fare ventrikül odalarının görselleştirme için bir yöntem tarif etmektir. Kalp Geliştirme doğrusal kalbini tüp oluşumu, döngü kalbini tüp ve dört odası septation içerir. Bu karmaşık işlemler son derece tüm omurgalıların korunmuş. Fare embriyonik kalp kalp gelişim çalışmaları için yaygın olarak kullanmıştır. Ancak, kendi son derece küçük boyutu nedeniyle, fare embriyonik kalp anatomi teknik olarak zordur. Buna ek olarak, In situ hibridizasyon, beta galaktozidaz LacZ muhabir fareler veya immunostaining kesitli embriyonik kalplerin kullanarak boyama görselleştirme kez kardiyak odası oluşumu ihtiyacı var. Burada, fare embriyonik kalp incelemek ve doğrudan ventrikül odası oluşumu MLC-2v-tdTomato farelerin bütün Dağı epifluorescent mikroskobu kullanarak görselleştirmek nasıl açıklar. Bu yöntemle, doğrudan kalp tüp oluşumu ve döngü ve dört odası oluşumu fare embriyolar daha deneysel manipülasyon olmadan incelemek mümkündür. Ne kadar MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fare çizgi bu protokol için bir örnek olarak kullanılır, bu iletişim kuralı diğer kalp özgü floresan muhabir transgenik fare satırlarına uygulanır.
Odası oluşumu kalp geliştirme sırasında birkaç morfolojik ayrı embriyonik aşamaları1,2ile geçiş karmaşık bir süreçtir. Kardiyak progenitör nüfus hücreleri hilal şeklinde bir doğrusal kalbini tüp oluşturur ve uzama ve gelişmekte olan kalp sarmal şekli oluşturmak için döngü sonra uğrar. Onun septation işleminden sonra gelişen kalp dört odacıklı kalp içine aktarılır. Bu işlemlerden herhangi bir kesinti gelişimsel kalp kusurları kaynaklanır. Böylece, odası oluşumu kalp geliştirme sırasında temel moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir. Kalp geliştirme konusunda çok sayıda önceki çalışmalarda rağmen anlayışımız bu karmaşık sürecin sınırlı kalır.
İn situ hibridizasyon, immünhistokimya ve beta galaktozidaz LacZ muhabir fare kullanarak boyama yaygın olarak kullanılan kalp belirli veya odası belirli yapısal genler etiketleme odası oluşumu sırasında fare kalp geliştirme çalışma ya da proteinler (örneğin, Nppa, darbe-TFII, Irx4, MLC-2a ve MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Ancak, birkaç farklı deneysel adımlar olmak zorunda çünkü fare embriyo kullanarak bu deneyler önemli zaman ve uzmanlık gerektiren sırayla gerçekleştirilen11. Burada, gelişen ventrikül MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler12den disseke embriyo kullanarak görselleştirmek için basit bütün Dağı epifluorescent mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Daha önce kullanılan yöntemlerine göre bu yöntemin avantajı kez deneysel varyasyonları oluşturabilirsiniz karmaşık deneysel adımlar kaçınmaktır. Bu iletişim kuralını temel amacı fare embriyo ve gelişmekte olan kalpleri teşrih ve sıkıcı histochemical deneyler olmadan fare kardiyak odası gelişiminin her aşamasında incelemek için nasıl tarif etmektir. Bu yöntem kalp geliştirme erken kardiyak işaretleri etiketleme çeşitli transgenik fare hatlarını kullanarak değerlendirmek için kolayca uygulanabilir (örneğin, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /MG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15ve TgMef2c-AHF-GFP16 fareler).
Burada açıklanan ventrikül veya kalp özgü yapısal genler veya proteinler etiketlemek için emek yoğun deneyler uygulamadan ventrikül odası geliştirme, incelemek nispeten basit yöntemdir. Bu nedenle, bu yöntemi sık sık immunostained kalp bölümlerde bulunan teknik variabilities en aza indirir.
Farelerin embriyonik yaş ve diseksiyon embriyonik kalplerin kesin tahmin dahil olmak üzere bu yöntemi başarıyla gerçekleştirmek için iki önemli adım vardır. Pratik olarak vajinal…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser NIH R03 HL140264 tarafından desteklenmiştir (Y.-J. N) ve Gilead Sciences araştırma bilim adamı programı (Y.-J. N).
dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |