Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza
Özet
Vi presentiamo i protocolli per esaminare lo sviluppo del cuore del mouse usando la microscopia intero Monte epifluorescente su embrioni di topo sezionati da ventricolare specifico MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in. Questo metodo permette di visualizzare direttamente ogni fase della formazione ventricolare durante lo sviluppo del cuore del mouse senza laboriosi metodi istochimici.
Abstract
L’obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo per la dissezione degli embrioni del mouse e visualizzazione delle camere ventricolari embrionali del mouse durante lo sviluppo del cuore usando topi knock-in reporter fluorescenti specifici ventricolare (MLC-2v-tdTomato topi). Sviluppo del cuore implica una formazione cuore lineare del tubo, il tubo di cuore looping e quattro camera settazione. Questi complessi processi sono altamente conservati in tutti i vertebrati. Il cuore di embrionali del topo è stato ampiamente usato per studi evolutivi di cuore. Tuttavia, a causa della loro dimensioni estremamente ridotte, cuori embrionali del topo di dissezione è tecnicamente impegnativo. Inoltre, visualizzazione di formazione camera cardiaca spesso ha bisogno di ibridazione in situ, beta-galattosidasi che macchia usando topi reporter LacZ, o immunostaining del cuore embrionale sezionato. Qui, descriviamo come sezionare cuori embrionali del mouse e visualizzare direttamente la formazione di camera ventricolare di MLC-2v-tdTomato topi usando la microscopia intero Monte epifluorescente. Con questo metodo, è possibile esaminare direttamente la formazione del tubo di cuore e loop e quattro formazione di camera senza ulteriore manipolazione sperimentale degli embrioni del mouse. Anche se la linea di topo knock-in reporter MLC-2v-tdTomato è utilizzata in questo protocollo come esempio, questo protocollo può essere applicato ad altre linee di topi transgenici reporter fluorescenti specifici del cuore.
Introduction
Formazione di camera durante lo sviluppo del cuore è un processo complesso, passando attraverso diversi stadi embrionali morfologicamente distinti1,2. La forma a mezzaluna cardiaco della popolazione delle cellule del progenitore forma un tubo lineare cuore e poi subisce allungamento e looping per formare la forma a spirale del cuore in via di sviluppo. Dopo il suo processo di settazione, cuore in via di sviluppo si trasforma in cuore quattro-a temperatura ambiente. Interruzione di uno qualsiasi di questi processi si traduce in difetti inerenti allo sviluppo del cuore. Pertanto, è importante capire i meccanismi molecolari sottostanti formazione camera durante lo sviluppo del cuore. Nonostante i numerosi studi precedenti su sviluppo del cuore, la nostra comprensione di questo complesso processo resta limitata.
L’ibridazione in situ, immunoistochimica e beta-galattosidasi che macchia usando topi reporter LacZ sono stati ampiamente usati per studiare la formazione di camera durante lo sviluppo del cuore del mouse dall’etichettatura cardiaci specifici o camera di specifici geni strutturali o proteine (ad es., Nppa, colpo di stato-TFII, Irx4, MLC-2a e MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Tuttavia, questi esperimenti con embrioni di topo richiedono molto tempo e competenze, perché diverse fasi sperimentali devono essere eseguite in sequenza11. Qui, descriviamo un metodo di microscopia semplice intero Monte epifluorescente per visualizzare i ventricoli sviluppo utilizzando embrioni dissecati dal MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in12. Il vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi precedenti è di evitare la complessa procedura sperimentale che spesso può creare variazioni sperimentali. Lo scopo principale di questo protocollo è descrivere come dissezionare embrioni di topo e cuori in via di sviluppo e di esaminare ogni fase dello sviluppo di alloggiamento cardiaco del mouse senza esperimenti istochimici noiosi. Questo metodo può essere applicato facilmente per valutare lo sviluppo di cuore utilizzando varie altre linee di topi transgenici etichettatura marcatori cardiaci precoci (ad es., Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15e topi16 TgMef2c-AHF-GFP).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto qui è relativamente semplice per esaminare lo sviluppo camera ventricolare, senza laboriosi esperimenti per etichettare ventricolare o cardiaci specifici geni strutturali o proteine. Quindi, questo metodo riduce al minimo tecnico variabilities che spesso sono stati trovati nelle sezioni immunostained cuore.
Ci sono due passaggi critici per l’esecuzione con successo questo metodo tra cui stima precisa dell’età embrionali di topi e dissezione del cuore embrionale. Stimiamo …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) e programma di Gilead Sciences Research Scholar (Y.-J. N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
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