نقدم البروتوكولات لدراسة التنمية قلب الماوس باستخدام الفحص المجهري كله جبل ابيفلوريسسينت على الأجنة الماوس تشريح من البطين محددة حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران. هذا الأسلوب يسمح لنا بتصور كل مرحلة تشكيل البطين خلال الماوس قلب التنمية دون أساليب histochemical كثيفة العمالة مباشرة.
والهدف من هذا البروتوكول وصف طريقة لتشريح الأجنة الماوس والتصور للدوائر البطين الجنينية الماوس أثناء تطوير قلب بطيني مراسل الفلورسنت محددة تدق في الفئران (الفئران حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو) باستخدام. قلب التنمية ينطوي على تشكيل أنبوب قلب خطي وأنبوب القلب حلقات أربعة الدائرة سيبتيشن. الغاية هي حفظت هذه العمليات المعقدة في جميع الفقاريات. قلب الجنينية الماوس تستخدم على نطاق واسع للدراسات الإنمائية القلب. نظراً لحجمها صغير للغاية، تشريح قلوب الجنينية الماوس غير تحديا من الناحية التقنية. وباﻹضافة إلى ذلك، التصور لتشكيل دائرة القلب وكثيراً ما يحتاج في الموقع التهجين، بيتا-جالاكتوسيداسي التلوين باستخدام لاكز مراسل الفئران، أو إيمونوستينينج من قلوب الجنينية مقطعة. هنا، نحن تصف كيفية تشريح قلوب الجنينية الماوس ومباشرة وضع تصور لتشكيل الدائرة البطين من حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو الفئران باستخدام الفحص المجهري كله جبل ابيفلوريسسينت. بهذه الطريقة، من الممكن مباشرة دراسة تشكيل أنبوب القلب وحلقات، وتشكيل الدائرة الأربع دون مزيد من التلاعب التجريبية للأجنة الماوس. على الرغم من أن يستخدم السطر الماوس في ضرب مراسل حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو في هذا البروتوكول كمثال، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على خطوط الماوس المعدلة وراثيا مراسل الفلورسنت الخاصة بالقلب الأخرى.
تشكيل الدائرة أثناء تطوير القلب عملية معقدة والانتقال عبر عدة مراحل الجنينية شكلياً مميزة1،2. شكل هلال من خلايا القلب السلف السكان يشكل أنبوب قلب خطي وثم يخضع لاستطالة وحلقات لتشكيل شكل دوامة قلب النامي. بعد عملية سيبتيشن، تتحول قلب النامية القلب أربع غرف. توقف أي من هذه العمليات ينتج عن تشوهات القلب التنموية. وبالتالي، من المهم فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تشكيل الدائرة أثناء تطوير القلب. وعلى الرغم من العديد من الدراسات السابقة في قلب التنمية، فهمنا لهذه العملية المعقدة لا يزال محدودا.
التهجين في الموقع، وإيمونوهيستوتشيميستري، وبيتا-جالاكتوسيداسي تلطيخ لاكز مراسل الفئران باستخدام قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة تشكيل الدائرة خلال الماوس قلب التنمية بوصفها القلب محددة أو الدائرة جينات هيكلية محددة أو البروتينات (مثل Nppa، تفيي الانقلاب، Irx4، 2a حركة تحرير الكونغو وحركة تحرير الكونغو-2v)3،4،5،6،،من78،9،10. ومع ذلك، تتطلب هذه التجارب باستخدام أجنة الفأر قدرا كبيرا من الوقت والخبرة، نظراً لأن العديد من الخطوات التجريبية المختلفة يجب أن تكون إجراء التسلسل11. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفحص المجهري ابيفلوريسسينت جبل كله بسيطة لتصور البطينين النامية استخدام الأجنة تشريح من حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران12. وميزة هذا الأسلوب مقارنة بالأساليب المستخدمة سابقا هو تجنب الخطوات التجريبية المعقدة التي غالباً ما قد تخلق اختلافات التجريبية. والغرض الرئيسي من هذا البروتوكول لوصف كيفية تشريح الأجنة الماوس وقلوب النامية ودراسة كل مرحلة من مراحل التنمية الدائرة القلب الماوس دون تجارب histochemical مملة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسهولة لتقييم التنمية القلب باستخدام مختلف خطوط الماوس المعدلة وراثيا الأخرى العلامات المبكرة علامات القلب (مثلاً، Mesp1Cre: Rosa26EYFP13، Isl1Cre: Rosa26EYFP13،14من Hcn4H2BGFP، Hcn4Cre: روزا طن متري /mG14، Nkx2-5Cre: روزا mT/ملغ14، Hcn4-اجفب15، Isl1Cre: روزا mT/ملغ14، Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15، والفئران16 TgMef2c-أف-التجارة والنقل).
الأسلوب الموصوفة هنا بسيط نسبيا لدراسة تطوير الدائرة البطين، دون إجراء تجارب ذات العمالة الكثيفة لتسمية الجينات الهيكلية البطين أو الخاصة بالقلب أو البروتينات. ومن ثم، يقلل هذا الأسلوب التقلبات التقنية التي تم العثور عليها غالباً في أقسام القلب إيمونوستينيد.
هناك اثنين م…
The authors have nothing to disclose.
أيد هذا العمل HL140264 R03 المعاهد الوطنية للصحة (ي. ج. N) وجيليد العلوم بحوث علماء البرنامج (ي. ج. N).
dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |