Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia
Özet
Presentamos los protocolos para examinar el desarrollo del corazón de ratón utilizando microscopía epifluorescente Monte todo en embriones de ratón disecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones. Este método nos permite visualizar directamente cada etapa de la formación del ventrículo durante el desarrollo del corazón de ratón sin mano de obra intensiva métodos histoquímicos.
Abstract
El objetivo de este protocolo es describir un método para la disección de embriones de ratón y visualización de cámaras ventriculares embrionarias de ratón durante el desarrollo del corazón con ventrículo reportero fluorescente específico knock-en ratones (MLC-2v-tdTomato). Desarrollo del corazón consiste en una formación de tubo lineal de corazón, el tubo de corazón bucle y cuatro de cámara de tabicación. Estos complejos procesos son altamente conservados en todos los vertebrados. El corazón embrionario de ratón ha sido ampliamente utilizado para los estudios del desarrollo del corazón. Sin embargo, debido a su tamaño extremadamente pequeño, disección de corazón de embrión de ratón es un desafío técnico. Además, la visualización de la formación de la cámara cardiaca a menudo necesita hibridación in situ, beta-galactosidasa que manchaba usando ratones de reportero LacZ, o immunostaining del corazón embrionario seccionado. Aquí, describimos cómo diseccionar el corazón embrionario de ratón y visualizar directamente la formación de la Cámara ventricular de MLC-2v-tdTomato ratones utilizando microscopía epifluorescente Monte todo. Con este método, es posible examinar directamente la formación del tubo corazón y bucle y 4 formación de la cámara sin más manipulación experimental de embriones de ratón. Aunque la línea de ratón knock-in de reportero de MLC-2v-tdTomato se utiliza en este protocolo como un ejemplo, este protocolo se puede aplicar a otras líneas de ratón transgénico de reportero fluorescente específica de corazón.
Introduction
Formación de la cámara durante el desarrollo del corazón es un complejo proceso de transición a través de varias etapas embrionarias morfológicamente distintos1,2. La forma crescent de células progenitoras cardíacas de la población forma un tubo lineal corazón y entonces sufre alargamiento y colocación para formar la forma espiral del corazón en desarrollo. Después de su proceso de tabicación, pleno en desarrollo se transforma en el corazón de cuatro cámaras. Interrupción de cualquiera de estos procesos resulta en defectos del desarrollo del corazón. Por lo tanto, es importante entender los mecanismos moleculares subyacentes la formación de la cámara durante el desarrollo del corazón. A pesar de numerosos estudios anteriores en el desarrollo del corazón, nuestra comprensión de este complejo proceso es limitada.
Hibridación in situ, inmunohistoquímica y la beta-galactosidasa coloración utilizando ratones de reportero LacZ han sido ampliamente utilizados para el estudio de formación de cámara durante el desarrollo del corazón de ratón por etiquetado cardiaco específico o compartimiento específicos genes estructurales o proteínas (por ejemplo, Nppa, golpe TFII, Irx4, MLC-2a MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Sin embargo, estos experimentos con embriones de ratón requieren mucho tiempo y conocimientos, porque varios pasos experimentales diferentes tienen que ser realizadas secuencialmente11. Aquí, describimos un método de microscopía epifluorescente de montaje todo simple para visualizar los ventrículos en desarrollo embriones disecados de MLC-2v-tdTomato reportero ratones knock-in12. La ventaja de este método en comparación con los métodos previamente utilizados es evitar complejos pasos experimentales que a menudo pueden crear variaciones experimentales. El objetivo principal de este protocolo es describir cómo diseccionar embriones de ratón y corazones en vías de desarrollo y examinar cada etapa de desarrollo de cámara cardiaca ratón sin experimentos histoquímicos tediosos. Este método se puede aplicar fácilmente para evaluar el desarrollo del corazón con varias otras líneas de ratón transgénico etiquetado marcadores cardiacos tempranos (por ejemplo, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: mT Rosa /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mG/mT14, eGFP Hcn415, Isl1Cre: Rosa mG/mT14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15y TgMef2c-AHF-GFP16 ratones).
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí es relativamente simple examinar el desarrollo de la Cámara ventricular, sin realizar experimentos que requieren mucho trabajo para etiqueta proteínas o genes estructurales cardiacos específicos o ventriculares. Por lo tanto, este método reduce al mínimo la variabilidad técnica que se encuentra a menudo en las secciones de corazón immunostained.
Hay dos pasos fundamentales para realizar con éxito este método como estimación precisa de la edad embrionaria de …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) y Gilead Sciences (Y.-J. programa de investigación N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
Referanslar
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
