Perfusão ex vivo da placenta de roedores

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Rutgers. 1. preparação antes do experimento Observação: essas etapas podem ser executadas dentro de dias/semanas antes do experimento. Modifique a câmara do vaso.Nota: a Figura 1a, B mostra a câmara de vaso único modificada. Mova o sensor de termistor de baixo do clipe e dobre-o para que ele pendure livremente no banho de perfusão (Figura 1b). Instale duas agulhas de aço inoxidável Blunt-Tip de 4 polegadas com os cubos padrão da conexão do luer, 1 25 g e 1 23 g fixados abaixo do grampo do termistor e adicione um torneira de 3 vias para permitir o canulação da vasculatura do cordão umbilical (Figura 1b).Nota: as conexões do luer de tamanhos diferentes do calibre são cor codificadas. Isso facilita a fácil identificação dos vasos durante e após o experimento. Instale dois micropipettes de vidro de 70 − 100 μm. Para obter mais informações sobre esses procedimentos, revise as seguintes referências10,11.Nota: o diâmetro da ponta comumente utilizado nestes experimentos está na faixa de 70 − 100 μm. os diâmetros da ponta maiores do que esta escala podem adicionar a dificuldade ao processo do canulação quando os diâmetros da ponta menores do que 60 μm podem perfurar a parede vascular durante o canulação. Prepare laços da sutura de nylon estéril (para extremidades proximal e longe do ponto de origem da artéria uterine) e da sutura não-estéril de seda trançada preta (para os vasos do cordão umbilical). Faça laços únicos por sutura looping como para iniciar um nó quadrado ou amarrar um sapato, como descrito anteriormente11.Nota: as únicas gravatas são feitas geralmente e mantidas em uma placa de Petri enchida com uma camada pequena de borracha de silicone para ajudar a trabalhar em um fundo pegajoso. Preparar 2 L de solução salina fisiológica (PSS) contendo, em mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2po4, 0,83 MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CAcl2e 5,5 glicose. Ajuste o pH para 7,40 ± 0, 2 Adicionando lentamente algumas gotas de ácido (1 M de ácido clorídrico) ou base (1 N hidróxido de sódio) à solução e aguarde pelo menos 20 s antes de ler a medição de pH ajustada. Armazene o PSS até estar pronto para uso na geladeira para reduzir a contaminação, mas não armazene por mais de 2 semanas. Tubos de microcentrífuga de etiquetas para coleta de efluentes “maternos” e “fetais” em cada ponto de tempo, ou seja, “MBaseline, M10, M20,…” até o ponto de tempo de 180 min. Prepare o mesmo para efluentes fetais (FBaseline, M10, M20,….). Calibrar todos os equipamentos utilizados no sistema, incluindo a temperatura do banho circulante e os monitores de pressão arterial associados à manutenção das pressões uterinas (80 mmHg) e do cordão umbilical (50 mmHg). Prepare uma câmara de dissecção (4 “de diâmetro x 1” de profundidade) ou um prato aquecedor circulante preenchendo uma camada (< 0,25 ") de borracha de silicone. Esta modificação deve ser feita adiantado e como tomará 12 − 24 h para que a borracha seque.Nota: o uso de um aquecedor de recirculação/prato de refrigeração é recomendado para cirurgiões novatos, como o prato não se moverá e o tecido manterá uma temperatura consistente. 2. preparação da estação cirúrgica e equilibração do equipamento Ligue todos os equipamentos que suportam o sistema de perfusão para verificar a função adequada. Retire o PSS da refrigeração e aqueça à temperatura ambiente. O PSS será usado como um perfusato e um superfusate. Coloc uma pedra borbulhando pequena para entregar uma mistura do gás no reservatório do superfusate. As misturas comumente usadas incluem 21% O2,3% o 2,3% o2e 0% o2. Ligue o gás para fornecer pequenas bolhas para a solução superfusate. Ajuste a entrega do gás para evitar espirrar. Organize a estação de dissecação de animais, verificando o anestésico, organizando equipamentos cirúrgicos e preparando laços de sutura. Prepare a câmara de dissecação coletando os pinos de dissecação, girando sobre o refrigerador (ou recuperando o gelo), e enchendo a câmara de dissecação (alinhada com o silicone de borracha) com PSS frio. Encha delicadamente todas as câmaras, agulhas, micropipettes de vidro, tubulação, e reservatórios com o PSS aquecido, observando com cuidado para e eliminando bolhas de ar aspiração os para fora com uma pipeta fina da transferência da ponta. Gire todos os stopcocks de 3 vias com “off” voltado para a direção da pipeta para fixar o fluido dentro da pipeta. Coloque um único empate em cada uma das duas Micropipetas de vidro preparadas para canulação uterina e nas duas agulhas de pontas sem corte designadas para canulação umbilical. Fixe os laços com as pipetas e as agulhas de pontas sem corte para evitar perdas durante os movimentos das câmaras (Figura 1C). 3. colheita placental Anestesiam um rato fêmea grávido no dia gestational 20 com o isoflurano de 5% por aproximadamente 4 minutos ou até que o animal apresente a respiração trabalhada. Mova o animal para o cone do nariz e administre 2,5% − 3% de isoflurano para manter a anestesia. Confirme a inconsciência por uma falta de reflexo de pitada de dedo do pé.Nota: o uso de um rato no dia gestacional 20 é apresentado neste protocolo. No entanto, o protocolo permanece o mesmo se as condições experimentais exigirem que a avaliação placentária ocorra precocemente na gestação. Identifique e isole o chifre uterine (direito ou esquerdo) da escolha levantando para fora e espalhando para fora longo-maneiras fora da carcaça do rato. Usando uma sutura de seda trançada, amarre a artéria uterina na extremidade do ovário e na extremidade vaginal do chifre. Inclua o ovário dentro da sutura com o chifre uterine. Usando tesouras cirúrgicas, extirpar afastado o chifre uterine fazendo cortes no lado proximal do laço do ovário e do lado longe do ponto de origem do laço vaginal, deixando o chifre uterine amarrado fora com as suturas em ambas as extremidades. Transfira o chifre uterine no prato de dissecação alinhado com a borracha de silicone e enchido com o PSS frio (de 4 ° c). Independentemente de se escolher a buzina direita ou esquerda, mantenha esse mesmo lado para seleção em cada experimento para consistência.Nota: para a anestesia fetal, filhotes são mantidos em gelo-frio PSS. Conseqüentemente, a temperatura de PSS dentro da câmara de dissecação é mantida pelo banho de circulação refrigerados ou a câmara de dissecação deve ser mantida no gelo.Nota: neste ponto a represa anestesiada pode ser eutanalizada por aprovação do protocolo IACUC de laboratório. Neste caso, a eutanásia ocorre através de pneumotórax (cortando o diafragma) e remoção do coração materno. Empurre delicadamente um pino de dissecação através do chifre uterine na borracha de silicone, com o lado do ovário à esquerda e ao lado vaginal à direita para visualizar o vasculature uterine. Isso estabilizará o útero e evitará o movimento do tecido durante a dissecção do compartimento fetal. Selecione uma unidade materno-placenta-fetal central ao chifre e ligadura a artéria e a veia uterine com tesouras cirúrgicas. Corte o músculo uterino proximal e distal à placenta e ao feto selecionados. O músculo uterino pode ser retraído puxando-o para o lado; é importante deixá-lo intacto, mas afastá-lo de cobrir o filhote fetal.Nota: a seleção da unidade materno-placenta-fetal deve basear-se no comprimento do segmento da artéria uterina em ambos os lados da artéria arcubada. Segmentos mais longos permitirão canulação mais bem-sucedida. Usando pinças finas e tesouras, retire a membrana amniótica da superfície fetal da placenta, tendo o cuidado de evitar o cordão umbilical. Desvendar e ligadura o cordão umbilical para separar o filhote fetal. Identifique a artéria umbilical (vaso mais espesso) e a veia (vaso mais fino). Marque a veia umbilical para fácil identificação cortando-a ligeiramente mais curta do que a artéria umbilical. Separe suavemente a artéria umbilical e a veia um do outro. Toda a unidade placentária, incluindo a vasculatura uterina, o músculo uterino, a placenta e o cordão umbilical, podem ser cortadas e removidas. 4. perfusão placentária Manter a circulação sanguínea anatômica que retém a orientação distal-à-proximal correta da artéria uterine, coloc a unidade placentária (compor do vasculature uterine, do músculo uterine, da placenta, e do cabo de cordão umbilical) na câmara isolada modificada do vaso enchida com PSS quente e oxigenado. Usando um par de fórceps fino em cada mão, canular as extremidades proximal e longe do ponto de origem da artéria uterine nas micropipettes de vidro. Fixe firmemente a artéria uterine usando o laço de sutura de nylon estéril fixado previamente na micropipeta.Nota: os laços do dois-laço (nó) podem ser necessários; Entretanto, um único laço do laço permite um ajuste mais grande. Cannulate a artéria do cordão umbilical (fluxo fetal-à-materno do sangue) na agulha de 23 G (maior) e prenda-a com a sutura de seda trançada preta. Cannulate a veia do cordão umbilical (fluxo de sangue materno-à-fetal) na agulha Blunt de 25 G (menor) e prenda-a com a sutura de seda trançada preta. Mova-se para a estação de perfusão placentária e preencha todos os stopcocks e Tubings para evitar bolhas de ar. Conecte todos os Tubings de acordo com a Figura 2. Coloc os barcos de peso pequenos o canulação longe do ponto de origem da artéria uterine materna e a canulação da agulha da veia de cordão umbilical fetal para travar o efluente que emergirá durante o procedimento. Gire sobre a bomba peristáltica, o controlador de pressão, e o monitor da pressão e abra o torneira para permitir o fluxo fluido através da tubulação para o transdutor de pressão, mas não ainda à placenta. Aumente lentamente a pressão para 80 mm Hg. Gire lentamente o torneira à placenta para abrir e prestar atenção para fugas dentro da câmara e em torno dos laços.Nota: se a bomba peristáltica estiver a funcionar a alta velocidade, reavalie a canulação uterina proximal e os laços para fugas de fluido. Se identificado, os vazamentos devem ser remediados. Observe também, enquanto a pressão média da artéria uterina permanecerá constante (definida para 80 mmHg), a vazão do fluido pode ser variável dependendo das respostas fisiológicas vasculares e placentárias. A quantificação do fluxo de fluido pode ser identificada como uma variável experimental em resposta à exposição xenobiótica. Gire o torneira para permitir o fluxo fluido na artéria do cordão umbilical. Definir a pressão para aproximadamente 50 mmHg, que pode ser implementado com uma bomba peristáltica (Figura 3) ou uma coluna hidrostática. Reabasteça todos os reservatórios (uterino, umbilical e superfusato) para manter o volume de fluido durante todo o experimento.Nota: uma vez iniciada a perfusão e o experimento está em andamento, os filhotes anestesiados que permanecem no prato de dissecação podem ser avaliados quanto à viabilidade, tocando os filhotes com fórceps para provocar uma resposta neurológica. A exsanguação dos filhotes ocorrerá por meio da histerectomia do chifre uterino; a eutanásia mais adicional pode ser terminada através dos protocolos aprovados de IACUC. Neste caso, abrindo o saco amniótico no PSS frio e criando um pneumotórax cortando as costelas. 5. experimento simulado Após a canulação e a iniciação da perfusão de PSS, deixe os tecidos equilibram por 30 minutos para permitir que o vasculatura ajuste ao fluxo fluido novo. Sucção até o efluente por uma pipeta e salvá-lo em um tubo de microcentrífuga correspondentemente rotulado. Após a equilibração, estabelecer a perfusão basal através da coleta de efluentes por 10 min de ambos os barcos de pesagem em tubos de microcentrífuga e medindo o volume de fluido que emerge através da artéria uterina e da veia umbilical. Iniciar a coleta da amostra em intervalos de 10 minutos coletando-se os efluentes da artéria uterina distal e da veia umbilical. Por exemplo, administrar uma dose de 900 μL de bolus de 20 nm de nanopartículas de poliestireno com rótulo de rhodamina (8 x 1014 partículas/ml) suspenso em 0, 1% surfactante para a linha perfusing a artéria uterina para identificar a passagem do curso de tempo de xenobiótico nanopartículas através da barreira placentária.Nota: estas amostras de efluente permitirão a medição de contaminantes dentro do fluido (tanto xenobiótico, farmacológico ou metabólito) e fornecer a taxa de fluxo de fluido através da artéria uterina ou através da placenta e para o compartimento fetal ( Figura 4). Após a infusão de bolus, coletar amostras da artéria uterina distal e efluente da veia umbilical fetal a cada 10 min para um total de 180 min após a infusão. 6. limpeza do equipamento Após cada experimento, retire a unidade placentária das pipetas. Todas as suturas podem ser salvas para serem reutilizadas em experimentos futuros. O tecido placentário pode ser guardado para estudos histológicos ou mecanísticos adicionais. Limpe todos os Tubings e cânulas do sistema de perfusão com 70% de etanol seguido de água destilada e vácuo seco.Nota: se Tubings ou pipetas começarem a descolorir ou aparecerem danificados, substitua antes do próximo experimento. Além disso, após a conclusão de uma coorte experimental (por exemplo, todos os estudos pertencentes a um único contaminante), substitua todos os Tubings dentro da câmara para evitar a contaminação cruzada.