啮齿类动物胎盘的体外灌注

所有实验程序都得到了罗格斯大学动物护理和使用机构委员会的批准。 1. 实验前的准备工作 注: 这些步骤可能会在实验前几天内执行。 修改容器室。注:图 1a, b显示了改进后的单容器腔。 将热敏电阻传感器从夹子下方移动并弯曲, 使其在灌注槽中自由悬挂 (图 1 b)。 安装两个4英寸的钝尖不锈钢针与标准的 luer 连接集线器, 一个 25 G 和一个 23 G 固定在热敏电阻夹下, 并添加一个三通塞子, 以允许插管的脐血管 (图 1 b)。注: 不同尺寸的 luer 连接采用彩色编码。这便于在实验期间和之后识别船只。 安装两个70-100μm 玻璃微移液器。关于这些程序的进一步资料, 请查阅以下参考资料10、11。注: 这些实验中常用的尖端直径在70-100μm 的范围内, 大于此范围的尖端直径可能会给插管过程增加难度, 而小于60微米的尖端直径可能会在插管过程中刺穿血管壁。 准备从无菌尼龙缝合线 (适用于子宫动脉的近端和远端) 和黑色编织丝非无菌缝合线 (为脐带血管) 的连接。如前面所述, 通过循环缝合来启动一个正方形的结或系鞋带, 使单打。注: 单一领带通常是制作和保存在培养皿充满了一小层硅橡胶, 以帮助工作在粘性背景。 制备含有2升生理盐溶液 (PSS), 在 mmol/L 中, 129.8 Ncl, 5.4 Kcl, 0.5 Nah2 po4, 0.83 mgso4, 19 nahco 3, 1.8 ccl2和5.5 葡萄糖.通过在溶液中缓慢加入几滴酸 (1M 盐酸) 或碱 (1 N 氢氧化钠), 将 pH 值调整到 7.40±0.02, 并等待至少20秒后再阅读调整后的 pH 值测量值。储存 PSS, 直到准备在冰箱中使用, 以减少污染, 但不储存超过2周。 标签微型离心管收集 “产妇” 和 “胎儿” 废水在每个时间点, 即, “M基线, M10, M20,…”最长180分钟的时间点。为胎儿排出物准备相同的东西 (F基线、M10、M20…)。 校准系统中使用的所有设备, 包括与维持子宫 (80 毫米汞柱) 和脐带 (50 毫米汞柱) 灌注压力相关的循环浴温和血压监测仪。 通过填充硅橡胶层 (< 0.25 "), 准备解剖室 (直径为 4" x 1 "深) 或循环加热器盘。这种修改必须提前进行, 因为橡胶干燥需要12-24小时。注: 建议新手外科医生使用循环热冷却盘, 因为该盘不会移动, 组织将保持一致的温度。 2. 手术站的准备和设备的平衡 打开所有支持灌注系统的设备, 以检查是否有正确的功能。从制冷设备中取出 PSS, 并将其加热至室温。PSS 将被用作一个香水和一个超级体。 放置一个小冒泡的石头, 将气体混合物输送到上部储集层。常用混合物包括 21% o2、8%O2、3% o2 和 0% o2.打开气体, 为排气液提供小气泡。调整气体的输送, 避免飞溅。 通过检查麻醉、安排手术设备和准备缝合纽带来安排动物解剖站。通过收集解剖销, 打开冷水机组 (或回收冰), 并在解剖室 (内衬橡胶硅胶) 填充冷 PSS, 准备解剖室。 用加热的 PSS 轻轻填充所有的腔室、针头、玻璃微管、油管和储罐, 用精细的尖端转移移液器将气泡吸出来, 从而仔细观察和消除气泡。打开所有三通的塞子, “关闭” 面对移液器的方向, 以固定移液器内的液体。 在为子宫插管准备的两个玻璃微管和两个指定用于脐插管的钝尖针头上放置一条领带。固定与移液器和钝尖针头的连接, 以防止在室内运动过程中丢失 (图 1c)。 3. 胎盘收获 在妊娠第20天用5% 异氟醚对怀孕的雌性大鼠进行约4分钟的麻醉, 或直到动物呼吸困难。将动物转移到鼻锥, 并给药 2.5%-3% 异氟醚, 以保持麻醉。确认无意识的缺乏脚趾捏反射。注: 本协议介绍了在妊娠第20天使用大鼠的情况。然而, 如果实验条件要求在怀孕初期进行胎盘评估, 则协议保持不变。 识别和隔离所选择的子宫角 (右或左), 通过抬出和传播出长期的方式外的大鼠尸体。使用编织丝缝合线, 绑在子宫动脉的卵巢末端和阴道端的角。包括与子宫角的缝合内的卵巢。 使用手术剪刀, 切除子宫角, 使切除的近端的卵巢领带和远端侧的阴道领带, 留下子宫角绑与缝合线两端。将子宫角放入用硅橡胶衬里的解剖盘中, 并填充冷 (4°C) PSS。无论选择的是右喇叭还是右角, 在每个实验中都要保持同一侧的选择, 以保持一致性。注: 对于胎儿麻醉, 幼崽被保存在冰凉的 PSS 中。因此, 解剖室内的 PSS 温度是通过冷循环浴来维持的, 也应该在冰上保持解剖室。注: 此时麻醉大坝可根据实验室 IACUC 协议的批准进行安乐死。在这种情况下, 安乐死是通过气胸 (通过切割横隔膜) 和切除母亲的心脏。 轻轻地将解剖销穿过子宫角推入硅橡胶, 将卵巢一侧向左推向右侧, 将阴道一侧向右推至右侧, 以显示子宫血管。这将稳定子宫, 防止在解剖胎儿隔间的过程中组织的运动。选择一个母亲胎盘-胎儿单位的中心角和结扎子宫动脉和静脉与手术剪刀。切子宫肌肉近端和远端的选定胎盘和胎儿。子宫肌肉可以通过拉到一边收回;重要的是要保持它的完整, 但拉它远离覆盖胎儿小狗。注: 母婴单位的选择应基于弧形动脉两侧子宫动脉段的长度。较长的段将允许更成功的插管。 使用精细的钳子和剪刀, 从胎盘的胎儿表面取出羊膜, 注意避免脐带。 解开脐带, 将胎儿幼崽分开。 识别脐动脉 (较厚的血管) 和静脉 (较薄的血管)。标记脐带静脉, 以便于识别, 方法是将其切割得比脐动脉稍短。 轻轻地将脐动脉和静脉彼此分开。 整个胎盘单位, 包括子宫血管, 子宫肌肉, 胎盘, 脐带, 可以被切断和删除。 4. 胎盘灌注 保持解剖血流保持子宫动脉远端至近端方向, 将胎盘单位 (由子宫血管、子宫肌肉、胎盘和脐带组成) 放入经修改的隔离血管室与温暖的, 含氧的 PSS。 每只手使用一对细钳, 将子宫动脉的近端和远端插管到玻璃微移液器上。 使用先前固定在微移液器上的无菌尼龙缝合系带, 紧固子宫动脉。注: 可能需要两个连接环 (结);但是, 单个平局循环允许更大的调整。 将脐动脉 (胎儿到产妇的血液流动) 固定在 23 G (较大) 的针头上, 并用黑色编织的丝绸缝合线固定在上面。 将脐静脉 (母婴血流) 固定在 25 G (较小) 钝针上, 用黑色编织的丝绸缝合线固定在上面。 移动到胎盘灌注站, 并回填所有的塞子和管, 以防止气泡。根据图 2连接所有管。 将小型称重船放置在母亲子宫动脉远端插管和胎儿脐静脉的针状插管下, 以捕捉手术过程中出现的污水。 打开蠕动泵、压力控制器和压力监测仪, 打开塞子, 允许流体通过油管流向压力传感器, 但尚未流向胎盘。慢慢将压力增加到80毫米汞。 慢慢地把塞子转向胎盘打开, 观察房间内和领带周围的泄漏。注: 如果蠕动泵以高速运行, 请重新评估近端子宫插管和液体泄漏的连接。如果发现, 必须纠正泄漏。另请注意, 虽然平均子宫动脉压力将保持不变 (设置为80毫米汞柱), 流体流量可能是可变的, 这取决于血管和胎盘的生理反应。流体流动的定量可以被确定为一个针对异生物暴露的实验变量。 转动塞子, 允许液体流入脐动脉。将压力设置为约50毫米汞柱, 可使用蠕动泵 (图 3) 或静压柱来实现。 在整个实验过程中, 填充所有储层 (子宫、脐带和叠加) 以保持流体体积。注: 一旦灌注已开始, 实验正在进行中, 麻醉后的幼崽留在解剖盘可能会评估是否可行, 通过触摸幼崽与钳子, 以引起神经反应。小狗的抽血将通过子宫角子宫切除术发生;进一步的安乐死可以通过经批准的 IACUC 协议来完成。在这种情况下, 打开羊膜囊在寒冷的 PSS 和创建一个气胸通过切割肋骨。 5. 模拟实验 插管和 PSS 灌注启动后, 让组织平衡 30分钟, 使血管适应新的流体流动。用移液器吸干废水, 并将其保存在相应的标记的微离心管中。 平衡后, 通过在微离心管中收集两艘称重船的污水 10分钟, 并测量通过子宫动脉和脐静脉出现的液体体积, 建立基线灌注。 通过收集子宫远端动脉和脐静脉的排出物, 每隔10分钟开始采集样本。例如, 在0.01% 表面活性剂中悬浮在使用子宫动脉的线上, 以确定异生物的时间过程纳米颗粒穿过胎盘屏障。注: 这些出水样本将允许测量液体 (异生物、药理学或代谢物) 内的污染物, 并提供流体通过子宫动脉或穿过胎盘进入胎儿隔间的速度 (图 4)。 输注丸后, 每10分钟从子宫远端动脉和胎儿脐静脉出水中采集一次样本, 输液后总共180分钟。 6. 设备清洁 每次实验后, 从移液器中取出胎盘单元。所有缝合线都可以保存, 以便在今后的实验中重复使用。胎盘组织可以保存为额外的组织学或机械研究。 用70% 乙醇清洗输液系统的所有管和插管, 然后进行蒸馏水和真空干燥。注: 如果管管或移液器开始变色或出现损坏, 请在下一次实验之前更换。此外, 在实验队列完成后 (例如, 与单一污染物有关的所有研究), 更换室内所有管, 以防止交叉污染。