Aquí se presenta un protocolo de perfusión vascular materno-fetal ex vivo para permitir la administración de un artículo de ensayo en vasculatura materna y para evaluar la transferencia placentaria de partículas xenobióticas o agentes farmacológicos, además de alteraciones en Fisiología placentaria.
La placenta es un órgano clave durante el embarazo que sirve como barrera para la exposición xenobiótica fetal y media el intercambio de nutrientes para los desechos. Aquí se describe un ensayo para perfulizar una placenta de rata aislada y evaluar la translocación materno-fetal de xenobióticos ex vivo. Además, la evaluación de procesos fisiológicos como el flujo de fluidos al feto y el metabolismo placentario pueden realizarse con esta metodología. Esta técnica es adecuada para evaluar la cinética materno-fetal de los candidatos farmacéuticos o contaminantes ambientales. En contraste con los enfoques alternativos actuales, esta metodología permite la evaluación de la vasculatura aislada materno-fetal, con la afectación sistémica neuronal o inmune eliminada, permitiendo que cualquier cambio observado en la función fisiológica sea atribuibles a factores locales dentro del tejido aislado.
Al mantener la estructura morfológica y la capacidad de respuesta fisiológica, la perfusión de órganos ha sido un método aceptado basado en el sistema o el tejido para analizar la función metabólica. Estas técnicas de perfusión permiten el examen ex vivo de las respuestas de los tejidos intactos a una variedad de estímulos farmacológicos y mecánicos. La perfusión de la placenta humana se describió inicialmente en 1958 para identificar los efectos hormonales sobre la actividad metabólica del ciclo del ácido cítrico; habiendo sido previamente identificados en homogeneizar tejidos, Troen y Gordon reconocieron la necesidad de aclarar la actividad endocrina utilizando un novedoso enfoque fisiológico1. En la misma época, se describieron estrategias de perfusión única (maternofetal o fetal a materna) en grandes modelos de2,3 y4 animales pequeños para comprender la transferencia placentaria de azúcares, sales y fármacos antipirinos. En vivo y ex vivo se describieron técnicas de perfusión dual (perfusión materna y fetal coordinada) para caracterizar aún más la transferencia placentaria utilizando las metodologías in vivo5 y ex vivo6,7,8 . Los avances tecnológicos en la microscopía electrónica de transmisión y escaneo permitieron a los investigadores verificar la integridad estructural y funcional de los tejidos placentarios humanos después de la perfusión9.
Mientras que la perfusión de los tejidos placentarios humanos y el cotiledón individual es más relevante, el rápido desarrollo de agentes farmacológicos y contaminantes ambientales requiere el uso de un modelo de perfusión animal para la detección temprana de xenobióticos transferencia a través de la barrera placentaria. Este método de perfusión placentaria permite la evaluación de la transferencia a través de la barrera placentaria utilizando la placenta de rata más fácilmente alcanzable y fisiológicamente relevante. Además, el flujo de fluido a través de la barrera placentaria durante un período de tiempo después de una exposición puede evaluarse midiendo el volumen de perfusato procedente de la arteria umbilical. En virtud de permitir la perfusión placentaria de las circulaciones maternas y fetales, este enfoque de órgano entero de doble flujo puede ser ventajoso en comparación con los enfoques actuales in vitro e in vivo. Este método permite medir la administración de un xenobiótico a través del aspecto materno a partir de un perfusato que emerge a través de la placenta a través de la vena umbilical, o viceversa. El protocolo presentado aquí describirá la transferencia de poliestireno de 20 Nm (un nanoplástico común utilizado en alimentos y productos médicos) de la arteria uterina materna al compartimiento fetal y una disminución asociada en el flujo de fluido a través de la placenta para ilustrar el uso de este método en múltiples entornos fisiológicos, farmacológicos y toxicológicos para evaluar la transferencia placentaria, el metabolismo y las alteraciones fisiológicas que afectan el flujo materno y/o fetal.
Este método de perfusión permite una evaluación rápida de la barrera placentaria y la función fisiológica de la vasculatura uterina y la capa de trofrogranos. La cannulación y la perfusión de los extremos proximal a distal de la arteria uterina materna simula la fisiología del flujo sanguíneo materno a través de este importante buque responsable de enviar sangre al feto en desarrollo. Esta metodología permite la evaluación fisiológica de la vasculatura aislada materna, placentaria y umbilical, y por lo tanto los cambios en la fisiología pueden ser identificados como patología vascular; Las inervaciones inmunológicas y neuronales se eliminan en el procedimiento ex vivo. Para garantizar una evaluación adecuada, por lo tanto es fundamental para acanale estos recipientes cuidadosamente para no crear lágrimas o pinchazos en las paredes de los vasos, y para eliminar las burbujas de aire. La émbolos de gas puede causar daños a la capa endotelial de la vasculatura u obstruir los vasos sanguíneos. Al mantener las conexiones vasculares entre el útero, la placenta y el feto durante la disección, se puede observar la evaluación del fluido y la translocación al feto. Con la administración de un xenobiótico, en este caso de poliestireno de 20 nm, la cinética al extremo distal de la arteria uterina y a través de la placenta hasta el compartimiento fetal puede evaluarse mediante el análisis de efluentes durante un curso de tiempo de 180 minutos.
Mientras que se describió un modelo de perfusión dual y se supervisó la transferencia de partículas y fluidos desde el compartimiento materno al fetal, las evaluaciones también se pueden hacer en reversa desde el feto hasta el compartimiento materno. Una limitación del método descrito aquí es que la vena uterina distal no se cannuló ni se muestreó. En futuros estudios, especialmente aquellos centrados en la transferencia fetal-materna, será importante acanale y muestrear el vaso uterino distal. Los efluentes tomados de este simulacro experimento se utilizaron para evaluar la transferencia xenobiótica; sin embargo, se puede realizar una amplia gama de evaluaciones relacionadas con las funciones placentarias y la nutrición fetal.
Los puntos fuertes de este protocolo superan con creces sus limitaciones menores. La preparación mantiene la estructura fisiológica y la integridad de todo un órgano para evaluar las condiciones experimentales. La perfusión placentaria ex vivo es una progresión científica que se basa en el sistema celular in vitro a la exposición de animales enteros para determinar adecuadamente la evaluación del riesgo reproductivo. Esto puede considerarse una técnica valiosa para los estudios que evalúan la disposición farmacológica de los fármacos placentarios, la farmacocinética, la toxicología, la fisiología y la medicina materno-fetal.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias de la salud ambiental (R00-ES024783), el centro Rutgers para exposiciones ambientales y enfermedades (P30-ES005022), y el programa de posgrado conjunto de Rutgers en Toxicología (T32-ES007148). También nos gustaría agradecer a los doctores Michael Goedken, Marianne Polunas y Pedro Louro por su experiencia técnica y al Dr. Adam Goodwill por su ayuda en el diseño de nuestro esquema de perfusión (figura 5).
Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |