Ex естественных условиях перфузии плаценты грызунов

Все экспериментальные процедуры были одобрены институциональным Комитетом по уходу и использованию животных Университета Ратджерса. 1. Подготовка перед экспериментом Примечание: эти шаги могут быть выполнены в течение нескольких дней/недель до эксперимента. Измените камеру сосуда.Примечание: Рисунок 1A, B показывает модифицированную одну камеру сосуда. Переместите термометр датчик из-под клипа и согнуть его так, что он висит свободно в ванне перфузии (рис. 1B). Установите два 4-дюймовый тупой наконечник из нержавеющей стали со стандартными концентраторов Luer соединения, 1 25 G и 1 23 G обеспеченных под Therme клип и добавить 3-Way стоп-кран, чтобы позволить канюли пуповины (рис. 1B).Примечание: Luer соединения различных размеров калибровочных кодируются цветом. Это облегчает идентификацию сосудов во время и после эксперимента. Установить два 70 − 100 мкм стеклянных микропипетей. Для получения дополнительной информации по этим процедурам, пожалуйста, просмотрите следующие ссылки10,11.Примечание: диаметр наконечника, обычно используемый в этих экспериментах, находится в диапазоне 70 − 100 мкм. диаметр наконечника больше, чем этот диапазон может добавить трудности в процессе канты, в то время как кончик диаметром меньше 60 мкм может пробить сосудистую стену во время Каня. Готовят галстуки из стерильного нейлонового шва (для проксимальных и дистальных концов артерии матки) и из черной плетеной шелковой нестерильной шов (для пуповинной сосудов). Сделать единичные связи на цикл шва, чтобы инициировать квадратный узел или связать ботинок, как описано ранее11.Примечание: одиночные связи обычно сделаны и хранятся в чашке Петри, заполненной небольшим слоем силиконовой резины, чтобы помочь работать на липком фоне. Подготовьте 2 л физиологического раствора соли (ПСБ), содержащего, в ммоль/л, 129,8 NCL, 5,4 KCl, 0,5 на2PO4, 0,83 mgso4, 19 нако3, 1,8 Касл2, и 5,5 глюкозы. Отрегулируйте рН до 7,40 ± 0,02, медленно добавляя несколько капель кислоты (1 м соляной кислоты) или базы (1 N гидроксид натрия) к решению и ждать по крайней мере 20 s перед чтением скорректированного измерения рН. Хранить ПСН до готовности к использованию в холодильнике для уменьшения загрязнения, но не хранить в течение более 2 недель. Маркировать микроцентрифужные трубки для сбора «материнских» и «фетальных» стоков в каждый момент времени, т. е. «MBaseline, М10,…» до точки 180 мин. Подготовить же для плода стоков (FBaseline, М10, М20,….). Калибровка все оборудование, используемое в системе, в том числе циркулирующих температуры ванны и артериального давления мониторы, связанные с поддержанием матки (80 мм рт. ст.) и пуповины (50 мм рт. ст.) перфусат давления. Подготовка камеры рассечения (4 “диаметр х 1” глубокий) или циркулирующего нагревателя блюдо, заполнив слой (< 0,25 ") из силиконовой резины. Это изменение должно быть сделано заранее и, как это займет 12 − 24 ч для резины высохнуть.Примечание: использование рециркуляционный обогреватель/охлаждения блюдо рекомендуется для начинающих хирургов, как блюдо не будет двигаться и ткань будет поддерживать последовательную температуру. 2. Подготовка хирургической станции и выравнивание оборудования Включите все оборудование, которое поддерживает систему перфузии для проверки надлежащей функции. Удалите ПСВ от охлаждения и теплой до комнатной температуры. ССО будет использоваться в качестве как перфусат, так и суперпурасат. Поместите небольшой пузырящийся камень, чтобы доставить газовую смесь в супербольшой резервуар. Часто используемые смеси включают 21% O2, 8% o2, 3% o2и 0% o2. Включите газа, чтобы обеспечить небольшие пузырьки для решения суперкопуты. Отрегулируйте поставку газа, чтобы избежать брызг. Организуйте анатомическую станцию животного, проверив анестезию, организовав хирургическое оборудование и подготовив шов. Подготовьте анатомический зал, собирая вскрывая булавки, поворачивая охладитель (или извлекая лед), и заполняя рассеивающий зал (облицованная резиновым силиконом) с холодной технической помощью. Аккуратно заполните все камеры, иглы, стеклянные микропипетки, трубки и резервуары с подогретой технической поддержки, тщательно следя за и устранение пузырьков воздуха путем отсасывания их с тонкой наконечник передачи пипетки. Поверните все 3-Way Стоп-краны с “OFF”, стоящих перед направлением пипетки, чтобы обеспечить жидкость в пипетку. Поместите один галстук на каждой из двух стеклянных микропипетей, подготовленных для Каня матки и на двух тупой наконечник иглы, предназначенные для пуповинной канниляции. Безопасные связи с пипетками и тупым наконечником иглы для предотвращения потерь во время движений камеры (рис. 1C). 3. заготовка плаценты Обезболивить беременную женскую крысу на гестационный день 20 с 5% изофлуран около 4 мин или до животного экспонатов затрудненное дыхание. Переместить животное в нос конуса и управлять 2,5% − 3% изофлуран для поддержания анестезии. Подтвердите бессознательное по недостатку рефлекса пальца ноги.Примечание: использование крысы при гестационном дне 20 представлено в этом протоколе. Тем не менее, протокол остается прежним, если экспериментальные условия требуют плацентарной оценки, чтобы иметь место ранее в гестации. Определить и изолировать рога матки (справа или слева) выбора, выподнимая и распространяя из длинных путей за пределами туши крысы. Использование плетеный Шелковый шов, галстук от матки артерии в конце яичника и вагинальный конец рога. Включите яичник внутри шва с рогом матки. Использование хирургических ножниц, акцизных от матки Рога путем сокращения на проксимальной стороне завязи галстук и Дистальная сторона вагинального галстука, оставляя рожок матки связали с швов на обоих концах. Перенесите рожок матки в Рассекающий блюдо с силиконовым резиной и наполните холодной (4 °C) технической помощью. Независимо от того, выбирается правый или левый Рог, поддерживайте ту же сторону для отбора в каждом эксперименте для обеспечения последовательности.Примечание: для фетальной анестезии, щенки хранятся в ледяной технической поддержки. Таким образом, температура технической поддержки внутри рассеивающей камеры поддерживается охлажденной циркуляционная Ванна или анатомический камера должна храниться на льду.Примечание: в этот момент наркотизированной плотины могут быть умерщвлены в лабораторных IACАC утверждения протокола. В этом случае, эвтаназия происходит через Пневмоторакс (путем разрезания диафрагмы) и удаление материнского сердца. Аккуратно нажмите Рассекающий штифт через рожок матки в Силиконовую резину, с яичник стороны слева и вагинальной стороны право визуализировать сосудистую матки. Это позволит стабилизировать матку и предотвратить движение ткани во время рассечения фетального отсека. Выберите материнское-плаценту-фетальную единицу центральную к Рожочок и лигате маточную артерию и Вену с хирургическими ножницами. Вырезать мышцы матки проксимальных и дистальнее выбранной плаценты и плода. Мышцы матки могут быть втянуты, потянув его в сторону; важно, чтобы оставить его нетронутым, но тянуть его от покрытия плода щенка.Примечание: в зависимости от длины сегмента маточных артерий по обе стороны дугуальной артерии выбор материнского-плацентарно-фетального блока должен быть основан на длине участка матки. Более длинные сегменты позволят добиться более успешной каннляции. При помощи тонких щипцов и ножниц удалите околоплодные мембраны с поверхности плода плаценты, заботясь о том, чтобы избежать пуповины. Разгадать и лигате пуповину, чтобы отделить плода щенка. Определите пупочную артерию (более толстый сосуд) и Вену (более тонкий сосуд). Отметьте пупочную вену для легкого отождествления путем разрезания его немного короче, чем пупочная артерия. Аккуратно отделим пупочную артерию и Вену друг от друга. Весь плацентарный аппарат, включающий сосудистую ткань матки, маточную мышцу, плаценту и пуповину, можно вырезать и удалить. 4. плацентарный перфузии Поддержание анатомического кровотока сохраняя правильные дистальной к проксимальной ориентации матки артерии, место плацентарного блока (состоящий из сосудов матки, маточных мышц, плаценты, и пуповины) в модифицированную изолированную камеру сосуда заполнены с теплой, насыщенной кислородом технической поддержки. Использование пары тонких щипцов в каждой руке, кантляции проксимальных и дистальных концах матки артерии на стекло микропипетки. Плотно закрепите маточную артерию с помощью стерильного нейлонового шовного шва, ранее обеспеченного на микропипетке.Примечание: два-галстук петли (узел) может быть необходимо; Тем не менее, одна петля галстук позволяет большую корректировку. Каннировать пуповину (фетальный-к-материнский кровоток) на 23 G (больше) иглы и закрепите его с черным плетеные шелка шов. Катетер пуповины (материнский поток крови плода) на 25 G (меньшая) тупая игла и закрепите ее черным плетеным шелковым шовным стеком. Переместить в плацентарной перфузии станции и засыпки все стоп-краны и тубингс для предотвращения пузырьков воздуха. Соедините все таббингс согласно фигуре 2. Поместите небольшие лодки весом под дистальной канной материнской артерии матки и иглы канниляция фетальной пуповинной Вены, чтобы поймать сточных вод, которые появятся во время процедуры. Включите перисталитический насос, контроллер давления, и монитор давления и открыть стоп-кран, чтобы разрешить поток жидкости через трубы к давлению преобразователя, но еще не к плаценте. Медленно увеличим давление до 80 мм рт. ст. Медленно поверните стоп-кран в плаценту, чтобы открыть и наблюдать за утечками внутри камеры и вокруг галстуков.Примечание: Если перисталетический насос работает на высокой скорости, пересмотреть проксимальной Каня и связей для утечки жидкости. В случае выявления утечки необходимо устранить. Также Отметим, в то время как среднее давление маточных артерий будет оставаться постоянным (установлен на 80 мм), скорость потока жидкости может быть переменной в зависимости от сосудистых и плацентарных физиологических реакций. Количественная оценка потока жидкости может быть определена в качестве экспериментальной переменной в ответ на воздействие ксенобибиотиков. Включите стоп-кран, чтобы поток жидкости в пупочную артерию. Установите давление примерно на 50 мм рт. ст., которые могут быть реализованы с перисталитическим насосом (рис. 3) или гидростатичной колонной. Пополнение всех водоемов (матки, пуповины и суперфузуты) для поддержания объема жидкости на протяжении всего эксперимента.Примечание: после начала перфузии и эксперимента, анестезированные щенки, оставшиеся в рассеивающей блюдо могут быть оценены для жизнеспособности, касаясь щенков с щипцами, чтобы вызвать неврологическую реакцию. Обескровливание щенков будет происходить через гистерэктомию рожка матки; Дальнейшая эвтаназия может быть завершена через утвержденные протоколы IACUC. В этом случае, открывая околоплодных вод в холодную ПСВ и создания пневмоторакс путем разрезания ребер. 5. макет эксперимента После канниляции и инициирования перфузии, пусть ткани выравниваются в течение 30 минут, чтобы сосуды могли адаптироваться к новому потоку жидкости. Всасывание стоков по пипетке и сохранить его в соответствующим образом помечены микроцентрифуга трубки. После equilibration, установить базовую перфузии путем сбора стоков на 10 мин от обоих судов весом в микроцентрифугических труб и измерения объема жидкости, которая возникает через маточной артерии и пупочной вены. Инициировать сбор образцов на 10-минутных интервалах путем сбора стоков из дистальных артерий матки и пупочной вены. Например, администрировать дозу 900 мкл болюса 20 Нм роденина-помечены наночастицы полистирола (8 х 1014 частиц/мл) приостановлено в 0,01% сурфактанта к линии перферное с помощью маточной артерии, чтобы определить время прохождения курса ксенобиотических наночастиц через плацентарный барьер.Примечание: эти образцы сточных вод позволит измерения загрязняющих веществ в жидкости (либо ксенобиотических, фармакологических, или метаболит) и обеспечить скорость потока жидкости через маточную артерию или через плаценту и в фетальном отсеке ( Рисунок 4). После болуса вливания, собирать образцы из дистальных артерий матки и фетальных пупочной вены стоков каждые 10 минут в общей сложности 180 мин после вливания. 6. Очистка оборудования После каждого эксперимента удалите плацентарный агрегат из пипетки. Все швы могут быть сохранены для повторного использования в будущих экспериментах. Плацентарные ткани могут быть сохранены для дополнительных гистологических или механистических исследований. Очистите все тубингс и канюли системы перфузии с 70% этанола следуют дистиллированной воды и вакуумной сухой.Примечание: Если тубингс или пипетки начинают обесцведелать или кажутся поврежденными, замените их до следующего эксперимента. Кроме того, после завершения экспериментальной когорты (например, все исследования, относящиеся к одному загрязнителя), замените все тубингс в камере, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.