げっ歯類胎盤の Ex 生体灌流

すべての実験手順は、「ラトガース大学の機関動物ケアおよびユース委員会」によって承認されました。 1. 実験前の準備 注: これらのステップは、実験の数日前または数週間以内に実行することができます。 容器室を改造する。注:図 1a、Bは、修正された単一容器室を示す。 サーミスタセンサーをクリップの下から動かし、散水槽に自由に垂れ下がるように曲げてください (図 1b)。 標準の luer 接続のハブが付いている4インチの鈍い先端のステンレス鋼の針を取付けなさい、1 25 G および 1 23 G はサーミスタクリップの下で固定し、臍の脈管構造の cannulation を可能にするために3方向活栓を加える (図 1b)。注: 異なるゲージサイズのルアー接続は色分けされています。これは実験の間に容器の容易な同一証明を促進する。 2つの70−100μ m ガラス micropipettes を取付けてください。これらの手順の詳細については、以下の参考文献10,11を参照してください。注: これらの実験で一般的に使用されるチップ直径は、70−100μ m の範囲です。チップ径がこの範囲よりも大きいと、cannulation プロセスが困難になり、60μ m より小さいチップ径が cannulation 中に血管壁を穿刺することがあります。 滅菌ナイロン縫合糸 (子宮動脈の近位および遠位端用) および黒色編組絹非滅菌縫合 (臍容器用) からの結合を準備する。前に説明したように、正方形の結び目を開始するか、または靴を結ぶためにループ縫合によって単一のネクタイを作る。注: 単一のネクタイは、一般的に作られており、粘着性の背景に作業を支援するためにシリコーンゴムの小さな層で満たさペトリ皿に保持される。 1ミリモル/L、129.8 NaCl、5.4 KCl、0.5 いいえ2PO4、0.83 MgSO4、19 NaHCO3、1.8 CaCl2、および5.5 グルコースを含む生理的塩溶液 (PSS) の 2 L を調製します。溶液に酸 (1 M 塩酸) または塩基 (1 N 水酸化ナトリウム) を数滴加えることにより pH を7.40 ±0.02 に調整し、調整された pH 測定を読む前に少なくとも20秒待ってください。PSS を冷蔵庫で使用できる状態になるまで保管して、汚染を減らしますが、2週間以上保管することはできません。 各時点で「母体」および「胎児」の廃水を収集するためのラベルマイクロ遠心管、すなわち、「MBaseline、M10、M20、…」180分 timepoint まで。胎児の廃水についても同じ準備をしてください (FBaseline、M10、M20、…)。 子宮 (80 mmHg) および臍 (50 mmHg) の灌流液圧力を維持するための循環浴温度および血圧モニターを含む、システム内で使用されるすべての装置を較正します。 解剖室 (4 “直径 x 1” 深い) またはシリコーンゴムの層 (< 0.25 ") を充填することにより、循環ヒーター皿を準備します。この変更は、事前に行う必要があり、それはゴムが乾くために12−24時間かかります。注意: 皿が動いていないと組織が一貫した温度を維持しますように、再循環ヒーター/冷却皿の使用は、初心者の外科医のために推奨されます。 2. 手術所の準備と設備の平衡化 灌流システムをサポートするすべての装置をオンにして、適切な機能をチェックします。PSS を冷蔵から室温に温めて取り外します。PSS は、灌流液と superfusate の両方として使用されます。 Superfusate 貯水池にガス混合物を送達するために、小さなバブリング石を配置します。一般的に使用される混合物には、21%O2、8% o2、3% o2、および 0% o2 があります。Superfusate 溶液に小さな気泡を提供するためにガスをオンにします。飛散を避けるために、ガスの配信を調整します。 麻酔をチェックし、外科手術器具を配置し、縫合糸の関係を準備することによって動物を解剖する場所を配置する。冷却装置を切開して解剖ピンを回収し、チラー (または氷を取り出す) をオンにして、コールド PSS で解剖室 (ゴムシリコーンで裏打ちされた) を充填します。 温めた PSS ですべてのチャンバ、針、ガラス micropipettes、チューブ、および貯水池を優しく満たし、慎重に監視し、微細なチップ搬送ピペットでそれらを吸引することにより、気泡を除去します。すべての3ウェイ stopcocks を「off」にしてピペットの方向に向け、ピペット内の流体を固定します。 子宮 cannulation と臍帯 cannulation 用に指定された2つの鈍い先端の針のために準備された2つのガラス micropipettes のそれぞれに1つのネクタイを置きます。部屋の動きの間に損失を防ぐためにピペットおよび鈍い先端の針への安全な関係 (図 1c)。 3. 胎盤の収穫 妊娠20日に妊娠した雌ラットを 5% イソフルランで約4分間、または動物が麻酔呼吸を示すまで。鼻コーンに動物を移動し、2.5% − 3% のイソフルランを投与して麻酔を維持する。つま先のピンチ反射の欠如によって無意識を確認します。注: 妊娠日20におけるラットの使用は、このプロトコールにおいて提示される。ただし、実験条件では、胎盤の評価を妊娠の早期に行う必要がある場合は、プロトコルは同じままである。 ラットカーカスの外に持ち上げて長い方法で広げることによって、選択の子宮の角 (右または左) を識別し、分離します。編組絹の縫合糸を使用して、卵巣の端と腟の末端で子宮動脈を結ぶ。子宮の角が付いている縫合線の中の卵巣を含んでいる。 手術用はさみを使用して、卵巣タイと膣のタイの近位側に切り込みを加えて子宮角を切除し、子宮角を両端の縫合糸で結んだままにする。シリコーンゴムが並ぶ解剖皿に子宮の角を移し、冷 (4 ° c) PSS で満たした。右または左のホーンが選択されているかどうかにかかわらず、一貫性のために各実験で選択のための同じ側面を維持します。注: 胎児麻酔のために、仔は氷冷 PSS で保持されます。したがって、解剖室内の PSS 温度は、冷間循環浴または解剖チャンバによって維持され、氷上で維持されるべきである。注: この時点で、ダムを麻酔して、実験室 IACUC プロトコルの承認ごとに安楽死させることができる。この場合、安楽死は、気胸 (横隔膜を切断することによる) および母体の心臓の除去によって起こる。 子宮の角を通って、シリコーンゴムに解剖ピンをそっと押し込み、卵巣側を左に、そして腟側を右にして子宮の脈管構造を視覚化する。これは子宮を安定させ、胎児コンパートメントの解剖の間にティッシュの動きを防ぐ。結紮の母体-胎盤-胎児ユニットを選択し、外科用はさみで子宮動脈と静脈を再使用します。選択された胎盤と胎児への子宮筋の近位および遠位を切断する。子宮の筋肉は、側に引っ張ることによって撤回することができます;それは無傷のままにしておくことが重要ですが、胎児の子犬を覆うからそれを引っ張ってください。注: 母体胎盤胎児単位の選択は、弓形動脈の両側の子宮動脈セグメントの長さに基づくべきである。長いセグメントは、より成功した cannulation を許可します。 微細な鉗子とはさみを用いて、胎盤の胎児表面から羊水を取り除き、臍帯を避けるように注意する。 結紮を解明し、胎児の子犬を分離するために臍帯を解きます。 臍動脈 (厚い容器) および静脈 (より薄い容器) を識別する。臍動脈よりも僅かに短く切断することによって容易に識別できるように臍静脈に印を付ける。 臍帯動脈と静脈を互いに優しく分離します。 子宮血管系、子宮筋、胎盤、および臍帯を含む全胎盤ユニットは、切断および除去され得る。 4. 胎盤灌流 子宮動脈の正しい遠位間配向を保持する解剖学的血流を維持し、胎盤ユニット (子宮脈管系、子宮筋、胎盤、および臍帯) を、充填された分離血管室に入れ暖かく、酸素化した PSS を使って。 それぞれの手で一組の微細な鉗子を使用して、cannulate は、ガラス micropipettes 上に子宮動脈の近位および遠位端を有する。 以前にマイクロピペットに固定されていた無菌ナイロン縫合ネクタイを使用して子宮動脈をしっかりと固定します。注: 2 つのタイ・ループ (ノット) が必要になる場合があります。ただし、単一のタイループでは、より大きな調整が可能です。 Cannulate (胎児から母体への血流) を 23 G (より大きい) 針に照射し、黒色の編組シルク縫合糸で固定する。 Cannulate (母子血流) を 25 G (小さい) 鈍い針に通し、黒色の編組シルク縫合糸で固定する。 胎盤灌流ステーションに移動し、気泡を防止するために、すべての stopcocks とチューブを埋め戻します。図 2に従ってすべてのチューブを接続します。 母親の子宮動脈の遠位 cannulation の下に小さな体重のボートを置き、処置の間に出てくる流出物を捕まえるために胎児の臍静脈の針の cannulation。 蠕動ポンプ、圧力コントローラ、圧力モニタをオンにして活栓を開き、圧力トランスデューサに向かってチューブを通る流体の流れを許可しますが、まだ胎盤にはありません。圧力を 80 mm Hg にゆっくりと増加させる。 ゆっくりと活栓を胎盤に回して、チャンバー内やネクタイ周りの漏れを観察します。注: 蠕動ポンプが高速で実行されている場合は、近位子宮 cannulation を再評価し、流体リークのためのネクタイ。特定された場合、リークを是正する必要があります。また注意してください、平均子宮動脈圧は一定のままであるが (80 mmHg に設定)、流体流速は、血管および胎盤の生理的応答に応じて可変であり得る。流体フローの定量化は、生体異物暴露に応答して実験変数として識別され得る。 活栓を回して、臍動脈への体液の流れを許可する。蠕動ポンプ (図 3) または静水圧列で実装できる約50の mmHg に圧力を設定します。 すべての貯留槽 (子宮、臍、および superfusate) を補充して、実験全体を通して体液量を維持します。注意: 灌流が開始され、実験が進行していると、解剖皿に残っている仔を麻酔し、神経学的応答を惹起するために鉗子で仔をタッチすることによって生存性を評価することができる。仔の Exsanguination は子宮角の子宮摘出術によって起こる。それ以上の安楽死は承認された IACUC プロトコルによって完了することができる。この場合、冷蔵 PSS で羊膜嚢を開き、肋骨を切断して気胸を発生させる。 5. 模擬実験 PSS 灌流の cannulation および開始後、組織を30分間平衡化して、血管系が新しい流体の流れに適応できるようにします。ピペットで排水液を吸い上げ、それに応じてラベルの付いたマイクロ遠心チューブに保存します。 平衡化の後、マイクロ遠心管の計量艇の両方から10分間の排水を回収し、子宮動脈と臍静脈を通して現れる体液量を測定することにより、ベースライン灌流を確立する。 遠位子宮動脈および臍静脈からの廃水を集めることによって10分間隔でサンプルコレクションを開始してください。例えば、20 nm のローダミン標識ポリスチレンナノ粒子 (8 x 1014粒子/ml) の900μ l のボーラス投与量を 0.01% の界面活性剤で懸濁させ、子宮動脈等量線に生体異物の時間経過を識別する。胎盤関門を横切るナノ粒子注: これらの廃水のサンプルは液体 (生体異物、薬理学的、または代謝物) 内の汚染物の測定を可能にし、子宮動脈を通して、または胎盤を渡ってそして胎児コンパートメントに液体の流れの速度を提供する (図 4)。 ボーラス注入後、遠位子宮動脈および胎児臍静脈廃水からの試料を、注入後に合計180分間、10分ごとに採取する。 6. 装置のクリーニング 各実験の後、胎盤ユニットをピペットから取り出します。すべての縫合糸は、将来の実験で再利用されるように保存され得る。胎盤組織は、さらなる組織学的または機械的研究のために保存されてもよい。 70% エタノールで灌流システムのすべてのチューブとカニューレを洗浄し、続いて蒸留水と真空乾燥します。注: チューブまたはピペットが変色し始めたり、破損していると思われる場合は、次の実験の前に交換してください。さらに、実験コホートが完了した後 (例えば、単一の汚染物質に関するすべての研究)、交差汚染を防止するためにチャンバ内のすべてのチューブを交換する。