Hier wird ein Protokoll der ex vivo mütterlich-fetalen Gefäßperfusion vorgestellt, um die Verabreichung eines Testartikels in die mütterliche Vaskulatur zu ermöglichen und die plazentale Übertragung von xenobiotischen Partikeln oder pharmakologischen Wirkstoffen zu bewerten, zusätzlich zu den Veränderungen in Plazentale Physiologie.
Die Plazenta ist ein Schlüsselorgan während der Schwangerschaft, das als Barriere für fetale Xenbiobiose dient und den Austausch von Nährstoffen gegen Abfall vermittelt. Hier wird ein Assay beschrieben, um eine isolierte Ratten-Plazenta zu perfektionieren und die mütterlich-fetale Translokation von xenobiotika ex vivo zu bewerten. Darüber hinaus kann mit dieser Methode die Auswertung physiologischer Prozesse wie Flüssigkeitsfluss zum Fötus und plakästigem Stoffwechsel durchgeführt werden. Diese Technik eignet sich zur Bewertung der kindlich-fetalen Kinetik von pharmazeutischen Kandidaten oder Umweltbelastungen. Im Gegensatz zu aktuellen alternativen Ansätzen ermöglicht diese Methodik die Bewertung der isolierten mütterlich-fetalen Vaskulatur, wobei die systemische neuronale oder Immunbeteiligung entfernt wird, so dass alle beobachteten Veränderungen in der physiologischen Funktion zu sein Aufgrund lokaler Faktoren im isolierten Gewebe.
Durch die Aufrechterhaltung der morphologischen Struktur und der physiologischen Reaktionsfähigkeit ist die Organperfusion ein anerkannter system-oder gewebebasierter Ansatz zur Analyse der Stoffwechselfunktion. Diese Perfusionstechniken ermöglichen die Ex-vivo-Untersuchung von intakten Gewebeanzeigen auf eine Vielzahl pharmakologischer und mechanischer Reize. Die Durchblutung der menschlichen Plazenta wurde ursprünglich 1958 beschrieben, um die hormonellen Wirkungen auf die Stoffwechselaktivität des Zitronensäurekreises zu identifizieren; Nachdem sie zuvor in Gewebehomogenaten identifiziert worden waren, erkannten Troen und Gordon die Notwendigkeit, die endokrine Aktivität mit einem neuartigen physiologischen Ansatzzuklären. In der gleichen Zeit wurden in großen Strategien von2, 3 und kleinen 4 Tiermodellen eine Einperfusions-(mütterlich-fett-oder fetalisch-zumütterliche) Strategien beschrieben, um die plazentäre Übertragung von Zucker, Salzen und Antipyrin-Medikamenten zu verstehen. In vivo und ex vivo Dual-Perfusion (koordinierte mütterliche und fetale Perfusion) Techniken wurden beschrieben, um die Plazental-Übertragung mit Hilfe von vivo 5und ex vivo 6,7,8 Methoden weiter zu charakterisieren. Technologische Fortschritte in der Übertragung und dem Scannen der Elektronenmikroskopie ermöglichten es Forschern, die strukturelle und funktionelle Integrität des menschlichen Plazenta-Gewebes nach der Perfusion zu überprüfen.
Während die Durchblutung von menschlichem Plazenta-Gewebe und individuellem Cotyledon am wichtigsten ist, erfordert die rasche Entwicklung pharmakologischer Wirkstoffe und Umweltbelastungen den Einsatz eines tierischen Perfusionsmodells für das frühe Screening von xenobiotischen Übertragung über die Plazenta-Barriere. Diese Plazenta-Perfusionsmethode ermöglicht die Auswertung der Übertragung über die Plazenta-Barriere mit leichter erreichbarer und physiologisch relevanter Ratten-Plazenta. Darüber hinaus kann der Flüssigkeitsfluss über die Plazenta-Barriere über einen längeren Zeitraum nach einer Exposition ausgewertet werden, indem das Volumen des Parusats aus der Nabelarterie gemessen wird. Durch die Möglichkeit der Plazenta-Perfusion sowohl aus den mütterlichen als auch aus den fetalen Kreisen kann dieser Dual-Flow-Ganzorgan-Ansatz im Vergleich zu aktuellen In-vitro und in vivo-Ansätzen von Vorteil sein. Diese Methode ermöglicht es, die Verabreichung eines Xenbiotikums durch den mütterlichen Aspekt aus dem Parfüm zu messen, das über die Plazenta durch die Nabelvene entsteht, oder umgekehrt. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Übertragung von 20 nm Polystyrol (ein häufiges Nanoplastikum, das in Lebensmitteln und Medizinprodukten verwendet wird) von der Gebärmutterarterie der Mutter in das fetale Fach und eine damit verbundene Abnahme des Flüssigkeitsflusses über die Plazenta zu illustrieren. Die Anwendung dieser Methode in mehreren physiologischen, pharmakologischen und toxikologischen Umgebungen zur Beurteilung der Plazenta-Übertragung, des Stoffwechsels und der physiologischen Veränderungen, die den mütterlichen und/fetalen Fluss betreffen.
Diese Perfusionsmethode ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Plazenta-Barriere und der physiologischen Funktion der Gebärmuttervaskulatur und der Trophoblastschicht. Die Konfektions-und Durchblutung der proximalen bis distalen Enden der Gebärmutterarterie der Mutter simuliert die Physiologie des mütterlichen Blutflusses durch dieses Hauptgefäß, das für die Blutung an den sich entwickelnden Fötus verantwortlich ist. Diese Methodik ermöglicht die physiologische Bewertung der isolierten mütterlichen, plazentären und umtriebigen Vaskulatur, und daher können Veränderungen in der Physiologie als Gefäßpathologie identifiziert werden; Die Immun-und neuronalen Innereien werden im Ex-vivo-Verfahren entfernt. Um eine ordnungsgemäße Auswertung zu gewährleisten, ist es daher wichtig, diese Schiffe sorgfältig zu kanülen, um keine Tränen oder Pünktchen in den Gefäßwänden zu erzeugen und Luftblasen zu entfernen. Gasemboli kann Schäden an der Endothelschicht der Vaskulatur verursachen oder Blutgefäße behindern. Durch die Aufrechterhaltung der Gefäßverbindungen zwischen Gebärmutter, Plazenta und Fötus während der Trennung kann die Beurteilung von Flüssigkeit und Translokation zum Fötus beobachtet werden. Mit der Verabreichung eines xenobiotischen, in diesem Fall 20 nm Polystyrol, kann die Kinetik bis zum distalen Ende der Gebärmutterarterie und durch die Plazenta zum fetalen Fach durch eine Analyse von Abwässern über einen Zeitverlauf von 180 Minuten ausgewertet werden.
Während in diesem Artikel ein Dual-Perfusionsmodell beschrieben und die Übertragung von Partikeln und Flüssigkeit aus dem Mutter-in das Fetalfach überwacht wurde, können auch umgekehrt vom Fetal-zum mütterlichen Fach beurteilungen vorgenommen werden. Eine Einschränkung der hier beschriebenen Methode ist, dass die distale Gebärmuttervene nicht kanalisiert oder gesampelt wurde. In zukünftigen Studien, insbesondere solche, die sich auf die fetal-mütterliche Übertragung konzentrieren, wird es wichtig sein, das distale Gebärmuttergefäß zu kanulieren und zu proben. Die Abwässer, die aus diesem Scheinversuch entnommen wurden, wurden verwendet, um den fremdebiotischen Transfer zu bewerten; Es kann jedoch eine Vielzahl von Beurteilungen zu endokrinen und molekularen Plazenta-Funktionen oder fetaler Ernährung durchgeführt werden.
Die Stärken dieses Protokolls überwiegen bei weitem seine geringfügigen Einschränkungen. Das Präparat bewahrt die physiologische Struktur und Integrität eines ganzen Organs, um experimentelle Bedingungen zu beurteilen. Ex vivo Plazentale Perfusion ist eine wissenschaftliche Weiterentwicklung von zellularhaltigen In-vitro-basierten zu einer ganzen tierischen Exposition, um die reproduktive Risikobewertung richtig zu bestimmen. Dies kann als eine wertvolle Technik für Studien angesehen werden, die die Plazenta-Pharmazie, Pharmakokinetik, Toxikologie, Physiologie und mütterlich-fetale Medizin bewerten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt vom Nationalen Institut für Umweltgesundheitswissenschaften (R00-ES024783), dem Rutgers Center for Environmental Exposures and Disease (P30-ES005022) und dem Rutgers Joint Graduate Program in Toxicology (T32-ES007148). Wir bedanken uns auch bei Dr. Michael Goedken, Marianne Polunas und Pedro Louro für die technische Expertise und Dr. Adam Goodwill für die Unterstützung bei der Gestaltung unseres Perfusionsschemas (Abbildung5).
Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |