On présente ici un protocole de perfusion vasculaire fœtale ex vivo pour permettre l’administration d’un article d’essai dans la vascularisation maternelle et pour évaluer le transfert placentaire de particules xénobiotiques ou d’agents pharmacologiques en plus des altérations de physiologie placentaire.
Le placenta est un organe clé pendant la grossesse qui sert de barrière à l’exposition xénobiotique fœtale et médie l’échange de nutriments pour les déchets. On décrit ici un dosage pour perfuser un placenta isolé de rat et pour évaluer la translocation maternelle à fœtale des xénobiotiques ex vivo. En outre, l’évaluation des processus physiologiques tels que le flux de fluide vers le fœtus et le métabolisme placentaire peut être effectuée avec cette méthodologie. Cette technique est adaptée à l’évaluation de la cinétique maternelle à fœtale des candidats pharmaceutiques ou des contaminants environnementaux. Contrairement aux approches alternatives actuelles, cette méthodologie permet l’évaluation de la vascularisation maternelle-fœtale isolée, avec l’implication systémique neuronale ou immunitaire enlevée, permettant à tous les changements observés dans la fonction physiologique d’être attribuable aux facteurs locaux dans le tissu isolé.
En conservant la structure morphologique et la réactivité physiologique, la perfusion d’organe a été une approche acceptée du système ou du tissu pour l’analyse de la fonction métabolique. Ces techniques de perfusion permettent l’examen ex vivo des réponses tissulaires intactes à une variété de stimuli pharmacologiques et mécaniques. La perfusion de placenta humain a été décrite initialement en 1958 pour identifier les effets hormonaux sur l’activité métabolique du cycle de l’acide citrique; ayant déjà été identifiés dans des homotrates tissulaires, Troen et Gordon ont reconnu la nécessité de clarifier l’activité endocrinienne à l’aide d’une nouvelle approche physiologique1. Dans la même période, des stratégies de perfusion unique (maternelle à fœtale ou fœtale à maternelle) ont été décrites dans les grands modèles2,3 et4 petits animaux pour comprendre le transfert placentaire des sucres, des sels et des médicaments antipyrine. On a décrit les techniques in vivo et ex vivo de double perfusion (coordination maternelle et fœtale) pour caractériser davantage le transfert placentaire en utilisant les méthodologies in vivo5 et ex vivo6,7,8 . Les progrès technologiques en microscopie électronique par transmission et par balayage ont permis aux chercheurs de vérifier l’intégrité structurelle et fonctionnelle des tissus placentaires humains après perfusion9.
Bien que la perfusion des tissus placentaires humains et du cotylédon individuel soit la plus pertinente, le développement rapide d’agents pharmacologiques et de contaminants environnementaux nécessite l’utilisation d’un modèle de perfusion animale pour le dépistage précoce des transfert à travers la barrière placentaire. Cette méthode de perfusion placentaire permet l’évaluation du transfert à travers la barrière placentaire à l’aide d’un placenta de rat plus facilement réalisable et physiologiquement pertinent. En outre, le débit de fluide à travers la barrière placentaire sur une période de temps après une exposition peut être évalué en mesurant le volume de perfusat provenant de l’artère ombilicale. En raison de la perfusion placentaire des circulations maternelles et fœtales, cette approche à double flux d’organes entiers peut être avantageuse par rapport aux approches in vitro et in vivo actuelles. Cette méthode permet l’administration d’un xénobiotique par l’aspect maternel à mesurer à partir du perfusat qui émerge à travers le placenta à travers la veine ombilicale, ou inversement. Le protocole présenté ici décrira le transfert du polystyrène de 20 nm (un nanoplastique commun utilisé dans les aliments et les produits médicaux) de l’artère utérine maternelle au compartiment fœtal et une diminution associée du débit de fluide à travers le placenta pour illustrer l’utilisation de cette méthode dans de multiples paramètres physiologiques, pharmacologiques et toxicologiques pour évaluer le transfert placentaire, le métabolisme et les altérations physiologiques affectant le flux maternel et/ou fœtal.
Cette méthode de perfusion permet une évaluation rapide de la barrière placentaire et de la fonction physiologique du vascularisation utérin et de la couche trophoblastique. La canulation et la perfusion des extrémités proximale à distale de l’artère utérine maternelle simulant la physiologie du flux sanguin maternel à travers ce grand vaisseau responsable de l’envoi du sang au fœtus en développement. Cette méthodologie permet l’évaluation physiologique de la vascularisation maternelle, placentaire et ombilicale isolée et, par conséquent, les changements de physiologie peuvent être identifiés comme Pathologie vasculaire; les innervations immunitaires et neuronales sont éliminées dans la procédure ex vivo. Pour assurer une évaluation appropriée, il est donc essentiel de cannuler ces vaisseaux avec précaution afin de ne pas créer de larmes ou de perforations dans les parois du vaisseau et d’enlever les bulles d’air. L’embolie gazeuse peut endommager la couche endothéliale de la vascularisation ou obstruer les vaisseaux sanguins. En maintenant les connexions vasculaires entre l’utérus, le placenta et le fœtus pendant la dissection, l’évaluation du liquide et de la translocation au fœtus peut être observée. Avec l’administration d’un xénobiotique, dans ce cas, le polystyrène à 20 nm, la cinétique à l’extrémité distale de l’artère utérine et par le placenta au compartiment fœtal peut être évaluée par l’analyse des effluents sur un cours de temps de 180 minutes.
Alors qu’un modèle à double perfusion a été décrit et que le transfert de particules et de fluides de la mère au compartiment fœtal a été contrôlé dans cet article, des évaluations peuvent également être effectuées à l’envers du fœtus jusqu’au compartiment maternel. Une des limitations de la méthode décrite ici est que la veine utérine distale n’a pas été cannulée ou échantillonnée. Dans les études futures, en particulier celles axées sur le transfert fœtal à maternel, il sera important de cannuler et d’échantillonner le vaisseau utérin distal. Les effluents prélevés dans ce simulacre d’expérimentation ont été utilisés pour évaluer le transfert xénobiotique; Cependant, un large éventail d’évaluations se rapportant aux fonctions placentaires endocriniennes et moléculaires ou à la nutrition fœtale peut être effectuée.
Les points forts de ce protocole dépassent de loin ses limitations mineures. La préparation maintient la structure physiologique et l’intégrité d’un organe entier pour évaluer les conditions expérimentales. La perfusion placentaire ex vivo est une progression scientifique de l’exposition in vitro à l’animal entier à base cellulaire pour déterminer correctement l’évaluation du risque de reproduction. Cela peut être considéré comme une technique précieuse pour les études évaluant la disposition pharmacologique placentaire de médicaments, la pharmacocinétique, la toxicologie, la physiologie, et la médecine maternelle-fœtale.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été appuyé par l’Institut national des sciences de la santé de l’environnement (R00-ES024783), le centre Rutgers pour les expositions et les maladies environnementales (ES005022), et le programme conjoint d’études supérieures de Rutgers en toxicologie (s-ES007148). Nous aimerions également remercier les Drs Michael Goedken, Marianne Polunas et Pedro Louro pour leur expertise technique et le Dr Adam goodwill pour son aide à la conception de notre schéma de perfusion (figure 5).
Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |